王芳,王嫘,張軍,尹勝武,華澤田

摘要：以高留胚率水稻遼粳２９４成熟胚為外植體，對影響高留胚率水稻愈傷組織誘導(dǎo)、分化的接種方式、培養(yǎng)基中激素水平進(jìn)行研究。結(jié)果表明，用解剖刀在胚上縱切1刀后再將種子接在培養(yǎng)基上，種子滅菌徹底，愈傷組織誘導(dǎo)率高且質(zhì)量較好。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素６－ＢＡ和ＫＴ的濃度對愈傷組織的誘導(dǎo)率有極顯著的影響，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Ｎ６＋２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．３ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＫＴ時，誘導(dǎo)率較高，可達(dá)９０．０％；分化培養(yǎng)基為ＭＳ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ?xí)r，綠苗分化效果好，分化率為７３．０％。

關(guān)鍵詞：高留胚率；遼粳２９４；成熟胚；愈傷組織；誘導(dǎo)及分化

中圖分類號：Ｓ５１１．２＋２；Ｓ３３６文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）05－1033-03

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｔｕｒｅ Ｅｍｂｒｙｏ ｏｆ Ｒｉｃｅ Liaojing 294 ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ｐｌｕｍｕｌｅ Ｒａｔｉｏ

ＷＡＮＧ Ｆａｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｌｅｉ１，ＺＨＡＮＧ Ｊｕｎ１，ＹＩＮ Ｓｈｅｎｇ－ｗｕ１，ＨＵＡ Ｚｅ－ｔｉａｎ１，２

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５７， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｔｉａｎｊｉｎ Ｔｉａｎｌｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ.， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５７， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏ ｏｆ Ｌｉａｏｊｉｎｇ ２９４ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｌｕｍｕｌｅ ｒａｔｉｏ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏ ｂｅｆｏｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ａｎ ｉｄｅａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｃａｌｌｕｓ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ６－ＢＡ ａｎｄ ＫＴ ｈａd ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ｔｏ ９０．０％ ｗｈｅｎ Ｎ６ ＋２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋ ０．３ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＫＴ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｐ ｔｏ ７３．０％ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ＭＳ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ ａｓ ｃａｌｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈｉｇｈ ｐｌｕｍule ｒａｔｉｏ； Ｌｉａｏｊｉｎｇ ２９４； ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏ； ｃａｌｌｕｓ； ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ

糙米各部位中，胚的蛋白質(zhì)含量最高，而且其還含有許多其他的營養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì)［１，２］，但胚在稻米的加工過程中較易脫落而不能被人們食用，損失了大量的營養(yǎng)成分［３］。遼粳２９４（原品系代號８７－６７５）是由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院稻作研究所選育的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻新品種［４］，其留胚率約為普通稻米的５～６倍，是不可多得的高留胚率水稻品種，是提高水稻的營養(yǎng)品質(zhì)以及雜交育種的好材料。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為作物品種特性定向改良的重要途徑之一，建立高效穩(wěn)定的再生體系則是實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的先決條件。成熟胚取材方便，不受生長季節(jié)和環(huán)境限制，外植體均勻、滅菌容易、重復(fù)性好，是遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體。利用水稻成熟胚建立高頻再生體系的研究已有一些報道［５－７］，但對高留胚率水稻成熟胚組織培養(yǎng)體系的研究報道很少。鄭文靜等［８］曾經(jīng)以遼粳２９４為材料研究過成熟胚的誘導(dǎo)率和分化率，但其組織培養(yǎng)條件下分化率較低（４１．７％）。為此，本研究以高留胚率水稻品種遼粳２９４的成熟胚為材料，對其愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代及分化條件進(jìn)行了分析，主要研究不同的接種方式、培養(yǎng)物中外源激素的劑量對水稻愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響，以期提高愈傷組織的質(zhì)量和再生率，建立一套穩(wěn)定、高效的高留胚率水稻的離體再生技術(shù)體系，為水稻基因工程和水稻育種服務(wù)。

１材料與方法

１．１材料

供試材料為遼粳２９４，由天津天隆農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

１．２方法

１．２．１外植體消毒選取成熟、飽滿、無病斑的水稻種子，剝?nèi)シf殼。在超凈工作臺上用無菌水浸泡１ ｈ，然后用體積分?jǐn)?shù)７０％的乙醇浸泡種子３ ｍｉｎ，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)０．１％的升汞溶液消毒１５～１０ ｍｉｎ，無菌水沖洗４～５次。

１．２．２愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)將消毒后的種子置于無菌濾紙上吸干水分，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，考察兩種不同的接種方式對誘導(dǎo)率的影響：①將種子直接接種在培養(yǎng)基上（處理Ⅰ）；②解剖刀在胚上縱切1刀后將種子接在培養(yǎng)基上（處理Ⅱ）。接種后２４～２６ ℃下暗培養(yǎng)７ ｄ，將初始的愈傷組織從種胚上剝離下來，轉(zhuǎn)接到新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)誘導(dǎo)３０ ｄ后，統(tǒng)計出芽率。誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基為Ｎ６＋２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋６－ＢＡ＋ＫＴ＋７．５ ｇ／Ｌ瓊脂＋４０ ｇ／Ｌ蔗糖＋５００ ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白，設(shè)置不同的６－ＢＡ濃度（０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ ｍｇ／Ｌ）和ＫＴ濃度（０、０．１、０．３、０．５、０．７、０．９ ｍｇ／Ｌ）組合，共３６個處理，每組９０個外植體，考察激素水平對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。

１．２．３分化培養(yǎng)繼代生長６０ ｄ后，選取生長旺盛、質(zhì)地緊密、自然分散、呈淡黃色顆粒狀的胚性愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基上（ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋７．５ ｇ／Ｌ瓊脂＋４０ ｇ／Ｌ蔗糖＋５００ ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白），培養(yǎng)條件為２４～２６ ℃、光照時間１４ ｈ／ｄ、光照度１ ５００～２ ０００ ｌｘ，培養(yǎng)３０ ｄ后可以觀察到綠點的出現(xiàn)，統(tǒng)計綠苗分化率。設(shè)置培養(yǎng)基中不同的ＮＡＡ水平（０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ ｍｇ／Ｌ），考察其對綠苗分化率的影響。

１．２．４再生植株的獲得將生長到長１ ｃｍ左右的綠芽叢切下后，接種在生根培養(yǎng)基（ＭＳ培養(yǎng)基）中，２０ ｄ左右逐漸生根，３０ ｄ后形成根系，此時，地上部分生長迅速，即可獲得完整再生小植株。

１．３統(tǒng)計方法

同一試驗的不同處理間首先進(jìn)行雙因素單個觀察值的方差分析（ｎ＝１０），當(dāng)差異顯著時進(jìn)行處理間的多重比較。愈傷組織誘導(dǎo)率＝誘導(dǎo)愈傷組織數(shù)／接種成熟胚數(shù)×１００％；綠苗分化率＝分化綠苗的愈傷組織塊數(shù)／轉(zhuǎn)移愈傷組織塊數(shù)×１００％。

２結(jié)果與分析

２．１不同接種方式對愈傷組織誘導(dǎo)率及分化率的影響

接種方式對愈傷組織的誘導(dǎo)率、生長速度、質(zhì)量及后期的分化率均有影響。處理Ⅰ愈傷組織出現(xiàn)較早、生長速度較快，但培養(yǎng)兩周后愈傷組織發(fā)干、生長緩慢，可能是因為處理Ⅰ是整粒種子進(jìn)行接種，內(nèi)源菌滅菌不徹底，阻礙了愈傷組織的繼續(xù)生長；處理Ⅱ愈傷組織出現(xiàn)較晚，培養(yǎng)約１０ ｄ后開始出現(xiàn)，但隨后生長加快，愈傷呈乳白色，表面疏松。

比較兩種接種方式下愈傷組織的誘導(dǎo)率及綠苗分化率，處理Ⅰ與處理Ⅱ愈傷組織的誘導(dǎo)率相差不多，但處理Ⅱ的綠苗分化率明顯高于處理Ⅰ（圖１），這可能是因為處理Ⅱ種子滅菌徹底，愈傷組織質(zhì)量較好，有利于幼苗的分化。綜上，確定本研究成熟胚的接種方式為處理Ⅱ，即解剖刀在胚上縱切1刀后將種子接在培養(yǎng)基上。

２．２成熟胚誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

將成熟胚接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，６～７ ｄ后可看到由盾片處長出初始愈傷組織，呈淡黃色，質(zhì)地緊密，繼代后愈傷組織體積逐漸變大，３０ ｄ后統(tǒng)計愈傷組織，結(jié)果見表１。由表１可見，培養(yǎng)基中不同濃度的６－ＢＡ與ＫＴ配合使用，都可以誘導(dǎo)出愈傷組織，但誘導(dǎo)率不相同。６－ＢＡ濃度為０．１ ｍｇ／Ｌ，ＫＴ濃度為０．５ ｍｇ／Ｌ時誘導(dǎo)率最高，達(dá)９２．２％；６－ＢＡ濃度為０，ＫＴ濃度為０．３或０．５ ｍｇ／Ｌ時誘導(dǎo)率最低，為３０％。

對３６種不同配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，６－ＢＡ與ＫＴ的濃度對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響達(dá)極顯著水平（Ｐ＜０．０１），且兩個激素間存在極顯著的互作效應(yīng)（Ｐ＜０．０１）。

對６－ＢＡ ６個濃度水平的平均誘導(dǎo)率進(jìn)行多重比較（表２），結(jié)果顯示，除０．２與０．４ ｍｇ／Ｌ處理、０與０．５ ｍｇ／Ｌ處理之間差異不顯著外，其他處理之間誘導(dǎo)率的差異均達(dá)到極顯著水平，６－ＢＡ濃度為０．３ ｍｇ／Ｌ平均誘導(dǎo)率最大，為８５．７％，０．５ ｍｇ／Ｌ時平均誘導(dǎo)率最小，只有３７．６％，可見過高或者過低濃度的６－ＢＡ均不利于愈傷組織的形成。

對６個ＫＴ濃度水平的平均誘導(dǎo)率進(jìn)行多重比較（表２），結(jié)果顯示，除０、０．１、０．３、０．５ ｍｇ／Ｌ與０．７、０．９ ｍｇ／Ｌ處理之間存在顯著差異（Ｐ＜０．０５），０、０．１、０．３、０．５ ｍｇ／Ｌ ４個處理，０．７與０．９ ｍｇ／Ｌ ２個處理之間誘導(dǎo)率的差異均不顯著（Ｐ＞０．０５）。０、０．１ ｍｇ／Ｌ與０．７、０．９ ｍｇ／Ｌ處理之間誘導(dǎo)率存在極顯著差異（Ｐ＜０．０１）。其中不添加ＫＴ時愈傷組織誘導(dǎo)率最高，但與0.1、0.3、0.5 ｍｇ／Ｌ的處理之間差異不顯著，ＫＴ濃度為０．９ ｍｇ／Ｌ時誘導(dǎo)率最低，可見低濃度的ＫＴ可以促進(jìn)愈傷組織的形成，其濃度過高會對愈傷組織的形成產(chǎn)生一定的抑制作用。

由于６－ＢＡ與ＫＴ之間的交互作用極顯著，所以還要對其交互作用進(jìn)行分析，進(jìn)而選出最優(yōu)的激素配比。通過單因素分析已經(jīng)確定６－ＢＡ濃度為０．３ ｍｇ／Ｌ時誘導(dǎo)率最高，ＫＴ在濃度為０～０．５ ｍｇ／Ｌ時作用效果差異不顯著，高于其他濃度水平。因此先確定６－ＢＡ的最佳濃度為０．３ ｍｇ／Ｌ，在此基礎(chǔ)上確定ＫＴ的最優(yōu)水平。６－ＢＡ濃度為０．３ ｍｇ／Ｌ時，ＫＴ濃度為０．１或０．３ ｍｇ／Ｌ，愈傷組織誘導(dǎo)率均為９０．０％，高于其他試驗組合，從試驗成本來看，選擇添加ＫＴ的濃度為０．１ ｍｇ／Ｌ。試驗結(jié)果中６－ＢＡ濃度為０．１ ｍｇ／Ｌ，ＫＴ濃度為０．５ ｍｇ／Ｌ時誘導(dǎo)率（９２．２％）比通過多重比較選出的最優(yōu)組合的誘導(dǎo)率（９０．０％）要高，但進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該組合的誘導(dǎo)率與周圍數(shù)據(jù)的變化趨勢明顯不一致，且驗證試驗的重復(fù)性也較差，因此，仍以統(tǒng)計學(xué)分析的最優(yōu)組合０．３ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＫＴ為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

２．３分化培養(yǎng)基中ＮＡＡ濃度對綠苗分化率的影響

將成熟胚接種到２．２優(yōu)化的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后分別將愈傷組織接種到含不同濃度ＮＡＡ的分化培養(yǎng)基中，４０ ｄ后統(tǒng)計綠苗分化率。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中ＮＡＡ的濃度對綠苗的分化率存在極顯著影響（Ｐ＜０．０１），ＮＡＡ濃度為０．８ ｍｇ／Ｌ時綠苗分化率最高（圖２）。ＮＡＡ濃度過高或過低均不利于綠苗的分化。

３小結(jié)與討論

以水稻成熟胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時，不同的接種方式會影響愈傷組織的誘導(dǎo)率和質(zhì)量，試驗結(jié)果表明用解剖刀在胚上縱切１刀后再將種子接種在培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織的效果要好于直接將種子接種于培養(yǎng)基上，這與呂孟雨等［９］的研究結(jié)果一致。培養(yǎng)基中的激素類型及水平也對水稻成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)率有影響。之前的研究發(fā)現(xiàn)Ｎ６培養(yǎng)基對于高留胚率的遼粳２９４愈傷組織的誘導(dǎo)效果較好，而分化培養(yǎng)基則以ＭＳ為基本培養(yǎng)基較好，２．０ ｍｇ／Ｌ的２，４－Ｄ比較適合于種胚愈傷組織誘導(dǎo)［１０，１１］。

在水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)中，常用的激素有６－ＢＡ、ＡＢＡ、２，４－Ｄ、ＫＴ等，不同實驗室所用的激素配比有較大差異，這可能與基因型、誘導(dǎo)培養(yǎng)基及激素等的相互作用有關(guān)。在本研究中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加了２，４－Ｄ、６－ＢＡ、ＫＴ 3種激素，通過試驗及統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，對于高留胚率的遼粳２９４來說，最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Ｎ６＋２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．３ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＫＴ；最佳的分化培養(yǎng)基為ＭＳ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ。本研究初步得出了一個高留胚率水稻成熟胚的最佳組織培養(yǎng)體系，為其他高留胚率水稻品種的成熟胚再生體系建立奠定了基礎(chǔ)。

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