林新瑜 王芳 林鴻剛 段西凌

[摘要]目的： 建立正常人表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)體系, 觀察不同濃度的白介素-1α，白介素-1β對體外培養(yǎng)正常人黑素細(xì)胞的細(xì)胞增殖及黑素合成的影響。方法：采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定白介素-1α及白介素-1β對黑素細(xì)胞增值的影響，NaOH裂解法測定黑素生成量，流式細(xì)胞儀檢測黑素細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果：白介素-1α及白介素-1β對黑素細(xì)胞活力有抑制作用,能使細(xì)胞增殖能力降低,黑素合成減少，增加黑素細(xì)胞的凋亡率。結(jié)論：白介素-1α及白介素-1β對體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞增殖及黑素生成都有抑制作用, 這為臨床應(yīng)用白介素-1α及白介素-1β治療色素性疾病提供了實驗依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]白介素-1α；白介素-1β；黑素細(xì)胞

[中圖分類號]R758[文獻標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）06-0952-04

黑素的合成是個極其復(fù)雜的過程,在體內(nèi)受金屬離子、細(xì)胞因子、激素等各種因素的調(diào)節(jié)。多種細(xì)胞因子對于黑素細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)、酪氨酸酶活性、細(xì)胞間粘附分子-1等均有不同程度的影響[1]。IL-1是一個多功能的促炎癥細(xì)胞因子家族,幾乎所有有核細(xì)胞均能產(chǎn)生IL-1。為了研究白介素-1（Interleutin-1, IL-1）對人表皮黑素細(xì)胞增殖及黑素合成的影響，為臨床應(yīng)用IL-1治療色素性疾病提供實驗依據(jù)，筆者建立了正常人表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，采用不同濃度的白介素-1α及白介素-1β作用于體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞, 觀察了IL-1α及IL-1β對表皮黑素細(xì)胞增殖及黑素合成的調(diào)節(jié)作用, 現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1材料和方法

1.1 材料及儀器：MCDB-153培養(yǎng)基，牛胰島素，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，L-Dopa, IL-1α，IL-1β，DMSO，MTT 均購自美國Sigma公司。重組人表皮生長因子( rhEGF)購于美國Peprotech公司。牛垂體提取物(BPE)購于美國Invitrogen公司。10%新生小牛血清購自Hyclone公司。EDTA-Na2購自美國Gibco公司。氫化可的松0.5μg/ml，青霉素100IU/ml，鏈霉素100IU/ml，胰蛋白酶，苔盼蘭均系國產(chǎn)。培養(yǎng)瓶、96孔板和6孔板均購于美國Corning公司；顯微鏡：觀察細(xì)胞用的是OLYMPUSCK2型號；細(xì)胞計數(shù)用的是OLYMPUSCKX41型號， 照相用的OLYMPUSCH2型號；酶聯(lián)免疫檢測儀；流式細(xì)胞儀。標(biāo)本經(jīng)患者知情同意后取自18～35歲行包皮環(huán)切術(shù)的正常人包皮。

1.2 方法

1.2.1 正常人黑素細(xì)胞的培養(yǎng)[2-3]：將上述包皮標(biāo)本消毒、修剪,用含0.2g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化和離心后,將獲得的MC 進行培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察, 細(xì)胞呈明顯的兩極或多極樹突形態(tài)。

1.2.2 黑素細(xì)胞鑒定[4-5]

1.2.2.1L-Dopa染色：將傳代純化后的黑素細(xì)胞，經(jīng)含0.2 g/L EDTA- Na2的0.25%胰蛋白酶消化后接種于已預(yù)先放置蓋玻片的 6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁并穩(wěn)定生長后棄去培養(yǎng)液，并用預(yù)熱的PBS液洗滌數(shù)次。用2.5g/L戊二醛固定后，加入用黑素細(xì)胞培養(yǎng)液配制的1g/L L-Dopa，37℃ 孵育4h，其間換液1次，風(fēng)干后甘油封片，照相。

1.2.2.2Fontana銀染：在0.15%硝酸銀溶液中加入適量氨水配制成氨銀液，將傳代純化的黑素細(xì)胞用戊二醛固定后加入氨銀液，避光浸染約30min，PBS液漂洗3次后置倒置顯微鏡下觀察，照相。

1.2.2.3S-100 蛋白免疫組化染色：將傳代純化后的黑素細(xì)胞，經(jīng)消化后接種于已預(yù)先放置蓋玻片的 6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后去掉培養(yǎng)液。用2.5g/L 戊二醛固定后，PBS液洗滌數(shù)次，加入3%的H2O2，室溫30min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶；再次用PBS液洗滌數(shù)次，滴加1：20稀釋的羊血清，室溫下處理15min；加入1:200兔抗 S-100蛋白的多克隆抗體，4℃ 過夜；洗滌后加入生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體，37℃、濕盒孵育1h，再次洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃、濕盒孵育1h。洗滌后DAB染色，蒸餾水適時終止，蘇木素復(fù)染后用加拿大膠封片，照相。

1.2.3 黑素細(xì)胞增殖的測定：采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT法）。 倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞培養(yǎng)至80%匯合時，棄培養(yǎng)液上清，加入含0.2 g/L EDTA- Na2的0.25%胰蛋白酶共1～1.5ml，在75cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)37℃孵育3～5 min，鏡下觀察約80%脫落，加入5ml左右的含有10%新生小牛血清的MDCB-153培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液到15ml離心管，1 500rpm離心3min，棄去上清，加入適量含有10%血清的MDCB-153培養(yǎng)基重懸細(xì)胞團塊，吸取100μl到一個無菌的500μl的EP管中，加入等量的0.8%的苔盼蘭溶液，室溫下混勻5min，吸取100μl混合液于血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。按20000個/ml接種到96孔板中，每孔150μl，37℃，5%CO2孵箱過夜培養(yǎng)。

第二天，棄去培養(yǎng)基上清，加入新鮮的MDCB-153培養(yǎng)基100μl /孔，備用。以無菌PBS配置的IL-1α，IL-1β溶液，其終濃度分別為50，100，200ng/ml，備用。無菌加入100μl相應(yīng)濃度的IL-1α，IL-1β溶液，同時設(shè)立PBS和空白對照組，各個濃度各設(shè)5個復(fù)孔。處理后分別培養(yǎng)24h，48h，72h。相應(yīng)處理時間后，分別棄去培養(yǎng)基上清，加入含MTT終濃度為0.5mg/ml的新鮮MDCB-153培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4h，800rpm離心3min，棄去培養(yǎng)基上清，加入150μl的DMSO溶解甲瓚，37℃孵育15min，于波長為495nm處測吸光度值，記錄數(shù)據(jù)，按公式計算其抑制率。抑制率=（對照組-實驗組）/對照組x100%。

1.2.4黑素合成的測定：采用NAOH法。將處理后的黑素細(xì)胞棄去上清液。PBS洗3次，用含0.2 g/L EDTA- Na2的0.25%胰蛋白酶消化3min后，分別計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞數(shù)目，取等數(shù)量的細(xì)胞離心后重懸于100μl的0.5mmol/L的NAOH溶液中， 37℃孵育1h后，各管加入400μl的蒸餾水稀釋后，分別于405nm處和450nm測量吸光度值，按公式計算其抑制率。黑素合成抑制率 =[1-(藥物孔吸光度值÷藥物孔細(xì)胞密度)÷(對照孔吸光度值÷對照孔細(xì)胞密度)]×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測：細(xì)胞培養(yǎng)，計數(shù)等如前，按2×105/孔接種到6孔板，濃度100ng/ml的IL-1α處理組，IL-1β處理組和PBS組，空白對照組設(shè)置如前，細(xì)胞處理72h后，分別收集培養(yǎng)基上清到離心管中，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，消化終止如前。分別收集細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)到相應(yīng)的已經(jīng)收集有各自上清的離心管里，1500rpm離心3min，棄去上清，加入無菌的PBS重懸細(xì)胞團塊，1500rpm離心3min，重復(fù)3次PBS清洗過程后，棄去上清，加入PI溶液，室溫避光孵育30min，上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理：全部數(shù)據(jù)采用 SPSS 統(tǒng)計軟件10.0版進行分析。

2結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果：體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞為雙極、 三極和多極的樹突狀細(xì)胞，細(xì)胞增殖良好,細(xì)胞樹突之間交織成網(wǎng) (見圖 1)。

2.2 黑素細(xì)胞鑒定

2.2.1 L-Dopa染色：第3代黑素細(xì)胞經(jīng)0.1 %L-Dopa染色后鏡下見黑素細(xì)胞胞質(zhì)及樹突均被染成灰黑色 (見圖2)。

2.2.2Fontana銀染：第3代黑素細(xì)胞經(jīng)氨銀液避光浸染30min，細(xì)胞被染成黑色（見圖3）。

2.2.3 S-100蛋白染色：黑素細(xì)胞胞質(zhì)及樹突呈棕黃色陽性著色,從而可以鑒定為黑素細(xì)胞(見圖4)。

2.3 不同濃度IL-1α對人正常皮膚黑素細(xì)胞增殖率(%)的影響：黑素細(xì)胞增殖的測定結(jié)果見表1。各濃度IL-1α實驗組對黑素細(xì)胞的抑制率較PBS對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05#或P<0.01*) 。從表1中可以看出隨作用時間增加，黑素細(xì)胞抑制率逐漸增加，而且隨IL-1的濃度增加，黑素細(xì)胞的抑制率也逐漸增加，說明其對黑素細(xì)胞的作用呈現(xiàn)出時間和劑量的相關(guān)性。

2.4 不同濃度IL-1β對人正常皮膚黑素細(xì)胞增殖率(%)的影響：黑素細(xì)胞增殖的測定結(jié)果見表2。各濃度IL-1β實驗組對黑素細(xì)胞的抑制率較PBS對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05#或P<0.01*) 。從表2中可以看出隨作用時間增加，黑素細(xì)胞抑制率逐漸增加，而且隨IL-1β的濃度增加，黑素細(xì)胞的抑制率也逐漸增加，說明其對黑素細(xì)胞的作用呈現(xiàn)出時間和劑量的相關(guān)性。

2.5黑素合成的測定結(jié)果：見表3。405nm處和450nm處分別測量吸光度值，按公式計算其黑素合成抑制率，均可見IL-1α及IL-1β作用后黑素合成抑制率增加，而且IL-1α及IL-1β組與PBS組比較統(tǒng)計學(xué)上均有顯著性差異（P<0.05#），但IL-1α及IL-1β兩組之間比較統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異（P＞0.05）。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測：濃度為100ng/ml 的IL-1α及IL-1β作用于黑素細(xì)胞72h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測的結(jié)果：空白對照組黑素細(xì)胞凋亡率為5.5%，溶劑PBS組黑素細(xì)胞凋亡率為6.7%，IL-1α（100ng/ml）組黑素細(xì)胞凋亡率為57.3%。IL-1β（100ng/ml）組黑素細(xì)胞凋亡率為56.6%。IL-1α（100ng/ml）組黑素細(xì)胞凋亡率與空白對照組及溶劑PBS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。IL-1β（100ng/ml）組黑素細(xì)胞凋亡率與空白對照組及溶劑PBS組比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.01）。但IL-1α及IL-1β兩組之間黑素細(xì)胞凋亡率的比較統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異（P＞0.05）。

3討論

IL-1 家族有3個主要成員, IL-1α、IL-1β和IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)。IL-1具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、 促進 T細(xì)胞和B 細(xì)胞的增殖與分化 ,參與免疫調(diào)節(jié)、 影響代謝、 刺激造血細(xì)胞及引起發(fā)熱等多種生物學(xué)作用[6]。人類皮膚內(nèi)的IL-1主要形式是IL-1α, IL-1β是次要形式[6-7]。Swope[8]等研究發(fā)現(xiàn)IL-1、 IL-6及TNF-α三種細(xì)胞因子可抑制培養(yǎng)黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性,其中IL-1最為明顯,此外它們還能抑制黑素細(xì)胞的生長，但無細(xì)胞毒性作用,故認(rèn)為它們可能是阻礙黑素細(xì)胞黑素生成的重要因素。本研究建立正常人表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)體系后 , 用不同濃度的IL-1α和IL-1β作用于黑素細(xì)胞后也發(fā)現(xiàn)IL-1α、IL-1β對黑素細(xì)胞活力有抑制作用 ,能使細(xì)胞增殖力降低,兩者存在明顯的劑量和時間效應(yīng)。濃度越高，抑制率越強，與 Swope等[8]的研究一致。本研究還發(fā)現(xiàn)IL-1α、IL-1β還可導(dǎo)致黑素合成減少，增加黑素細(xì)胞的凋亡率。顧勁松等[9]采用放射免疫分析法測定白癜風(fēng)患者血清細(xì)胞因子水平，泛發(fā)性患者血清IL-1β水平均顯著高于對照組。Lu Y等[10]學(xué)者用角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的IL-1處理黑素細(xì)胞發(fā)現(xiàn)可以刺激括細(xì)胞間黏附分子-1的顯著表達。LePoole等[11]觀察到, 白癜風(fēng)患者皮損處黑素細(xì)胞周圍基質(zhì)中, 細(xì)胞間黏附分子表達明顯增高，高表達的細(xì)胞間黏附分子可以顯著抑制黑素細(xì)胞與纖維粘連蛋白的黏附, 導(dǎo)致黑素細(xì)胞缺失。IL-1作為多功能的促炎癥細(xì)胞因子,是否為參與引起炎癥后色素脫失的主要因素，在白癜風(fēng)的發(fā)病過程中起著怎樣的作用， IL-1α、IL-1β究竟是通過什么通路和機制達到這些作用還有待進一步的深入研究。

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[收稿日期]2012-02-21[修回日期]2012-04-03

編輯/張惠娟