蘆慧 魏賽金 涂曉嶸 徐佳 涂國全
摘要:離體條件下,采用菌絲生長速率法和菌絲干重法測定新型多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素——抗真菌霉素702和制霉色基素對水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻菌核病菌(Helminthosporium sigmoideum Cav.)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)4種水稻病原真菌的抗菌活性和毒力。結(jié)果表明,抗真菌霉素702和制霉色基素對4種水稻病原真菌具有較強的抗菌活性,50 μg/mL抗真菌霉素702對水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌的抑菌率分別為100.00%、100.00%、91.72%和68.06%, EC50分別為7.00、10.30、14.41、26.71 μg/mL, EC90分別為13.20、17.66、27.67、128.28 μg/mL。13 μg/mL制霉色基素對水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌的抑菌率分別為78.20%、100.00%、100.00%和79.17%, EC50分別為1.47、1.91、2.37、0.20 μg/mL,EC90分別為41.05、3.92、4.34、135.54 μg/mL??傮w上,制霉色基素對4種水稻病原真菌的抑菌活性強于抗真菌霉素702。
關(guān)鍵詞:鏈霉菌702;抗真菌霉素702;制霉色基素;抗菌活性;水稻病原真菌
中圖分類號:S451.21文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2012)06-1123-05
Studies on Antifungal Activity and Toxicity ofNew type Polyene Antibiotics on Four Kinds of Rice Pathogenic Fungi
LU Hui,WEI Sai-jin,TU Xiao-rong,XU Jia,TU Guo-quan
(College of Biological Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University,Nanchang,330045,China)
Abstract: The antifungal activity and toxicity of new type polyene macrolide antibiotics-Antifungalmycin 702 and Fungichromin on Rhizoctonia solani, Helminthosporium sigmoideum Cav., Magnaporthe grisea and Ustilaginoidea virens were studied by mycelia growth rate method and hypha dry weight method in vitro. The results showed that both of the Antifungalmycin 702 and Fungichromin had strong antifungal activities on the four kinds of rice pathogenic fungi. Treated with 50μg/mL Antifungalmycin 702, the inhibitory rates on Rhizoctonia solani, Helminthosporium sigmoideum Cav., Magnaporthe grisea and Ustilaginoidea virens were 100.00%, 100.00%, 91.72% and 68.06%, and the EC50 (μg/mL) and EC90 (μg/mL) were 7.00, 10.30, 14.41, 26.71 and 13.20, 17.66, 27.67, 128.28 respectively. Treated with 13μg/mL Fungichromin, the inhibitory rates on the four kinds of rice pathogenic fungi were 78.20%,100.00%,100.00% and 79.17%, and the EC50 (μg/mL) and EC90(μg/mL) were 1.47, 1.91, 2.37, 0.20 and 41.05, 3.92, 4.34, 135.54 respectively. The antifungal activity of Fungichromin was stronger than Antifungalmycin 702.
Key words: streptomyces 702; Antifungalmycin 702; Fungichromin; antifungal activity; rice pathogenic fungi
江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院南昌市發(fā)酵應(yīng)用重點實驗室在進行以棉花枯萎病為靶標的農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選研究中,從棉田土壤中分離篩選到一株鏈霉菌,編號702。該菌所產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)在微量濃度下對細菌、霉菌和酵母菌均有極強的抑制作用[1]。從鏈霉菌702的發(fā)酵液中提取到抗細菌單體活性組分S2和抗真菌活性單體組分DZP-8及DZP-9,分別進行了鑒定??辜毦鷨误w活性組分S2在中國科學院上海有機化合物研究所協(xié)助下鑒定為9種氨基酸組成的環(huán)肽,分子質(zhì)量
1 269 u,分子式C62H84N12O17,為國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)和鑒定,命名紅谷霉素[2]。抗真菌活性單體組分在中國科學院昆明植物研究所協(xié)助下進行鑒定,抗真菌活性單體組分DZP-9和DZP-8均為多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素。DZP-9分子質(zhì)量和分子式分別為670 u和C35H58O12,DZP-8的分子質(zhì)量和分子式分別為為704 u和C35H60O14。通過CAS檢索結(jié)構(gòu)式發(fā)現(xiàn)DZP-9與已知的制霉色基素(Fungichromin)同質(zhì)[3-5],DZP-8未見報道,是一種新型多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,命名為抗真菌霉素702(Antifungalmycin 702)。多烯類抗生素是一類目前臨床常用藥中最不容易產(chǎn)生抗藥性的抗真菌抗生素[6,7],開發(fā)高效低毒的多烯類抗真菌抗生素是抗真菌藥物研發(fā)的有效途徑之一。
本試驗研究抗真菌霉素702和制霉色基素對水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌4種水稻病原真菌的抗菌活性和毒力。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1抗真菌活性物質(zhì)抗真菌活性物質(zhì)DZP-8,即抗真菌霉素702 (純度99.46%);DZP-9,即制霉色基素(純度99.57%),均由江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院應(yīng)用微生物實驗室提供,用甲醇溶解配成1 000 mg/L和130 mg/L溶液。
1.1.2供試菌水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻菌核病菌(Helminthosporium sigmoideum Cav.)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)菌株由江西農(nóng)業(yè)大學教學實訓基地提供。
1.1.3培養(yǎng)基供試菌斜面、平板培養(yǎng)基均采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA);液體培養(yǎng)基采用PD培養(yǎng)基。
1.2試驗方法
1.2.1抗真菌霉素702和制霉色基素對3種水稻病原真菌的毒力鑒定將水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌菌株接種至PDA平板上,水稻紋枯病菌和水稻菌核病菌于30 ℃培養(yǎng)2 d,稻瘟病菌于27 ℃培養(yǎng)4 d,用內(nèi)徑8.8 mm打孔器打取菌落邊緣菌絲作為接種物。
采用菌絲生長速率法[8]進行毒力鑒定。將抗真菌霉素702和制霉色基素藥液分別稀釋1、2、4、8、16倍,吸?。?mL不同濃度的藥液與9 mL冷卻至50 ℃的PDA培養(yǎng)基充分混勻制成系列濃度的含藥平板,以添加等量無菌水的平板為空白對照(CK)。用打孔器打取水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌菌餅,將菌餅移至各含藥平板中央,適溫培養(yǎng),同一處理重復3次。對照平板上菌落布滿培養(yǎng)皿2/3時,用游標卡尺十字交叉法測量并記錄各菌落直徑,菌絲凈生長量為菌落直徑與菌餅直徑之差,菌絲生長抑制率(抑菌率)按以下公式計算:
抑菌率=
■×100%。
計算抗真菌霉素702和制霉色基素對水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑菌率。利用DPS統(tǒng)計軟件采用劑量對數(shù)-抑菌率機率值法[9]計算EC50、EC90及毒力回歸方程。
1.2.2抗真菌霉素702和制霉色基素對稻曲病菌的抑制作用和毒力鑒定采用菌絲干重法[10]。將稻曲病菌菌株接種于30 mL PD液體培養(yǎng)基中,于26 ℃ 160 r/min搖床培養(yǎng),制備均一的出發(fā)菌株。將不同濃度的抗真菌霉素702和制霉色基素加入已滅菌的PD培養(yǎng)基中制備成不同含藥量的培養(yǎng)基,再接入等量均一的稻曲病菌,置于26 ℃ 160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)6 d。?。矎埗繛V紙在分析天平上稱重,質(zhì)量分別記為a1和b1。取某一處理濃度培養(yǎng)下的供試菌培養(yǎng)物用a1過濾并收集濾液,瀝干后將附有菌絲體的濾紙稱重記為a2;取濾液用b1過濾,瀝干后將濾紙稱重記為b2,菌體質(zhì)量=(a2-a1)+(b2-b1)。利用上述方法測出抗真菌霉素702和制霉色基素不同濃度作用下稻曲病菌的菌體質(zhì)量。以不含抗真菌霉素702和制霉色基素的PD培養(yǎng)基為空白對照,計算2種藥劑對稻曲病菌的抑菌率,同一處理重復3次。利用DPS統(tǒng)計軟件,采用劑量對數(shù)-抑菌率機率值法計算EC50、EC90及毒力回歸方程。
2結(jié)果與分析
2.1抗真菌霉素702對水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑制作用和毒力
抗真菌霉素702對水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌具有較強的抑制作用。由試驗結(jié)果(表1)可知,50 μg/mL抗真菌霉素702對水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑菌率分別達到100.00%、100.00%和91.72%;EC50和EC90分別為7.00、10.30、14.41 μg/mL和13.20、17.66、27.67 μg/mL。比較各處理EC50和EC90值可知,抗真菌霉素702對水稻紋枯病菌的EC50和EC90最低,抑菌活性最強。
2.2制霉色基素對水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑制作用和毒力
由制霉色基素對水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌的抑制作用和毒力測定結(jié)果(表2)可見,13 μg/mL制霉色基素對水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑菌率分別為78.20%、100.00%和100.00%;EC50和EC90分別為1.47、1.91、2.37 μg/mL 和41.05、3.92、4.34 μg/mL。綜合比較各處理的EC50和EC90值可知,制霉色基素對這3種病原菌的抑菌活性由強到弱依次為水稻菌核病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌。
2.3抗真菌霉素702和制霉色基素對稻曲病菌抑制作用和毒力
采用菌絲干重法測定抗真菌霉素702和制霉色基素對稻曲病菌的抑制作用和毒力,測定結(jié)果見表3。從表3可見,抗真菌霉素702和制霉色基素對稻曲病菌均有一定抑制效果,50 μg/mL抗真菌霉素702對稻曲病菌的抑菌率為68.06%,而13 μg/mL制霉色基素對稻曲病菌的抑菌率可達79.17%,其EC50分別為26.71、0.20 μg/mL,EC90分別為128.28、135.54 μg/mL。
3小結(jié)與討論
3.1抗真菌霉素702和制霉色基素對水稻4種病原真菌的抑菌活性和毒力比較
抗真菌霉素702和制霉色基素是鏈霉菌702菌株所產(chǎn)的2種抗真菌單體組分,對水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌均有較強的抑制作用,且對不同病原菌的抑制作用差異較大??拐婢顾兀罚埃矊λ炯y枯病菌的抑菌活性最強,其次為水稻菌核病菌、稻瘟病菌、稻曲病菌。制霉色基素對水稻菌核病菌抑菌活性最強,其次為稻瘟病菌、水稻紋枯病菌、稻曲病菌??拐婢顾兀罚埃苍冢担?μg/mL時對水稻紋枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌的抑菌率分別為100.00%、100.00%、91.72%和68.06%,而制霉色基素在濃度僅為13 μg/mL時對這4種病原菌的抑菌率則分別達到78.20%、100.00% 、100.00%和79.17%,抑制作用明顯強于抗真菌霉素702。毒力測定結(jié)果顯示,抗真菌霉素702對4種水稻病原菌的EC50為7.00~26.71 μg/mL,EC90為13.20~128.28 μg/mL;制霉色基素對4種水稻病原菌的EC50為0.20~2.37 μg/mL,EC90為3.92~135.54 μg/mL,綜合比較可知,制霉色基素對這4種水稻病原菌的毒力強于抗真菌霉素702。
3.2抗真菌霉素702和制霉色基素的分子式相似但抑菌活性差異較大的原因分析
抗真菌霉素702和制霉色基素的分子式非常相似,抗真菌霉素702的分子質(zhì)量比制霉色基素多34 u,相當于多2個OH基,但試驗結(jié)果顯示二者抑菌活性差異較大。分析原因,可能是因為其化學立體結(jié)構(gòu)不相同,兩組分的化學立體結(jié)構(gòu)差異有待于進一步通過X衍射試驗來確定,從而從化學立體結(jié)構(gòu)上的差異來解釋2組分抑菌活性不同的原因。如青霉素的化學結(jié)構(gòu)中不僅β-內(nèi)酰胺鍵的化學活性影響其抑菌活性,分子母核的其他結(jié)構(gòu)特征也起著重要作用[11]。
抗真菌霉素702和制霉色基素均為新型多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素,對于多烯類抗生素的抑菌活性機理,還未有精確闡釋的文獻報道。目前研究一般認為,多烯類抗生素抑菌機理主要體現(xiàn)在對病原菌細胞膜結(jié)構(gòu)功能的破壞上[12,13],如納他霉素(Natamycin)主要作用于真菌細胞質(zhì)膜,與質(zhì)膜中含有的麥角甾醇作用損傷細胞質(zhì)膜,造成細胞內(nèi)物質(zhì)泄漏,從而起到抑菌作用[14,15]??拐婢顾兀罚埃埠椭泼股貙λ静≡婢囊志饔脵C理是否與納他霉素相似、是否還存在其他作用機制導致二者抑菌效果的較大差異,還有待于進一步研究。
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