馮進云 李萍 江賢萍 彭振輝

[摘要]目的：探討細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1／2(ERKl／2)及其活性形式磷酸化ERKl／2(p-ERKl／2)在血管瘤組織中的蛋白表達及其意義。方法：應用免疫組織化學sP法，檢測2 3例增生期血管瘤組織及1 9例退化期血管瘤組織ERK1／2和p—ERK1／2的蛋白表達。結(jié)果：增生期血管瘤組織與退化期血管瘤組織ERKl／2的蛋白表達無統(tǒng)計學差異(z=-0.305，P>0.05)；增生期血管瘤組織p-ERKl／2的蛋白表達顯著高于退化期血管瘤組織的表達(z=-4.271，P<0.01)結(jié)論：增生期血管瘤組織p-ERKl／2呈高表達，血管瘤的增生與ERK通路的激活有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]血管瘤；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶

[中圖分類號]R732.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-6455(2012)07-1163-02

細胞外信號調(diào)節(jié)激酶

(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是介導和調(diào)控細胞外信號到細胞內(nèi)反應的重要激酶。ERK主要有ERKl和ERK2兩種亞型。ERKl和ERK2常被稱為ERK1／2。磷酸化ERK1／2(phospho～ERR1／2，p-ERK1／2)是ERK的活性形式。ERK信號通路是與增殖相關(guān)的關(guān)鍵信號通路。嬰幼兒血管瘤簡稱血管瘤，是嬰幼兒時期最常見的良性腫瘤。增生期血管瘤的組織病理學特征為血管內(nèi)皮細胞的過度增殖。有關(guān)血管瘤內(nèi)皮細胞增生的機制目前尚不清楚。

由于增生期血管瘤存在內(nèi)皮細胞的過度增殖，而ERK信號通路是與增殖相關(guān)的關(guān)鍵信號通路，據(jù)此推測增生期血管瘤可能存在ERK通路的激活；因此，有必要了解增生期血管瘤組織中ERK通路的活性狀況。由于ERK是ERK信號通路下游的核心元件，因而可通過檢測ERK的活性來了解ERK信號通路的狀況。本研究采用免疫組織化學SP法檢測增生期血管瘤組織和退化期血管瘤組織中ERK1／2及p-ERK1／2的蛋白表達，以探討ERR1／2、p-ERK1／2及ERR通路在血管瘤發(fā)病中的作用。

1材料和方法

1.1診斷標準：參照Mulliken分類法，進行增生期血管瘤和退化期血管瘤的診斷。增生期血管瘤以條索狀或團塊狀增生的內(nèi)皮細胞為主，血管腔無或小，細胞間結(jié)締組織少：退化期血管瘤以血管為主，血管腔增大，內(nèi)皮細胞減少，血管間結(jié)締組織增多。

1.2標本收集：選取2009年4月～2011年11月深圳市兒童醫(yī)院手術(shù)切除的嬰幼兒皮膚血管瘤石蠟包埋標本42例，其中增殖期血管瘤23例，退化期血管瘤19例。將增生期血管瘤設(shè)為實驗組，將退化期血管瘤對照組。23例增殖期血管瘤中，男5例，女18例，年齡1月～8月(平均4.3月)；19例退化期血管瘤中，男4例，女14例，年齡3月～23月(平均12.1月)。兩組病變均大多位于頭頸、軀干部。

1.3主要試劑：兔抗p-ERK單克隆抗體(CST，#4377S)、兔抗ERK單克隆抗體(CST，#4695S)購自美國Cell signalingTechnology公司；免疫組化sP超敏試劑盒(KIT-5020，羊抗鼠／兔)和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物公司。1.4檢測方法：石蠟切片脫蠟置水：于檸檬酸鹽修復液中(0.01mM，pH6.0)，高壓鍋修復1.5～2.0min；滴加3％H1202，室溫10min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫10～15min；滴加1：500稀釋的兔抗ERK抗體、兔抗p-ERK抗體，空白對照用PBS代替一抗，置于濕盒內(nèi)，4℃過夜；滴加復合二抗(HRP—Polymer Anti Ms／Rb IgG)，室溫20 rain：DAB顯色：蘇木精復染；鹽酸酒精分化；脫水；透明；封片。

1.5結(jié)果判斷：每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)。按細胞染色深淺及顯色細胞所占比例，進行結(jié)果判斷。按細胞染色深淺計分：無染色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；按顯色細胞占細胞總數(shù)比例計分：<5％為O分，5％～25％為1分，26％～50％為2分，>50％為3分。染色積分=(1)+(2)；染色強度按積分分級：0～1分為(一)，2分弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，>4分為強陽性(+++)。1.6統(tǒng)計學處理：運用SPSSl2.O軟件，對實驗數(shù)據(jù)進行Man-Whitney.U檢驗。

2結(jié)果

ERKl／2主要表達于胞漿，部分表達于胞核。p-ERKI／2主要表達于胞核，部分表達于胞漿。ERKl／2和p-ERKl／2在增生期血管瘤及退化期血管瘤中的細胞染色強度及顯色細胞所占比例見表1。增生期血管瘤組織中ERKl／2的表達(圖1)與退化期血管瘤組織中ERKl／2的表達(圖2)相比較，無統(tǒng)計學差異(z=-0.305，P>0.05)。增生期血管瘤組織p-ERK1／2的表達(圖3)與退化期血管瘤組織p-ERKl／2的表達(圖4)相比較，差異有顯著性意義(z=-4.271，P<0.01)。

3討論

ERK是介導和調(diào)控細胞外信號到細胞內(nèi)反應的重要激酶。ERK信號通路是與增殖相關(guān)的關(guān)鍵信號通路。ERK是ERK信號通路下游的核心元件。ERK正常定位于胞漿，當它被激活后轉(zhuǎn)位至胞核。ERK的活化是將信號從細胞膜表面受體轉(zhuǎn)導至核的關(guān)鍵，只有p-ERK才具有活性?；罨腅RK可以磷酸化c-FOS、c-JUN、NF-Kb等蛋白，維持細胞的正常生長、發(fā)育。ERK過度活化后，可通過影響cyclin、MITF及MMP等因子，促使細胞生長過度和分化不良，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

目前尚無有關(guān)血管瘤組織ERRl／2的報道，而有關(guān)血管瘤組織p-ERKl／2的報道少見。ERKl／2蛋白包括磷酸化ERKl／2蛋白以及非磷酸化ERKl／2蛋白。本研究中，增生期血管瘤組織與退化期血管瘤組織ERKl／2的蛋白表達無差異，這說明血管瘤的增生可能與ERK蛋白表達水平無關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，與退化期血管瘤組織相比，增生期血管瘤組織p-ERKl／2呈高表達，這一結(jié)果與有關(guān)的報道_5相一致；這說明血管瘤的增生與ERK的磷酸化水平有關(guān)，即血管瘤的增生與ERK的過度活化及ERK通路的激活有關(guān)。

ERK活化的大致路徑為：胞外刺激一細胞表面受體一Ras→Raf→MEK→ERK。目前，已有一些關(guān)于ERK信號通路的胞外信號或受體在血管瘤中高表達的研究報道。例如，Takahashi等發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子在增生期血管瘤內(nèi)皮細胞內(nèi)高表達；Ritter等發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子一2在血管瘤增生期高表達；Reggiani等認為，雌激素及其受體與血管瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。因此，ERK的過度活化與多種可激活ERK信號通路的胞外信號及受體的高表達有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)血管瘤的增生與ERK的過度活化及ERK通路的激活有關(guān)；這一方面在細胞信號轉(zhuǎn)導水平上闡述了血管瘤的一種發(fā)病機制，另一方面提示在治療血管瘤時可選用作用于ERK通路尤其是ERK的抑制劑。