付文娟，趙濟(jì)華，甘洪全，翟宏芳，李琪佳

凋亡抑制蛋白FLIP是新近發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移侵襲密切相關(guān)的因子。其全稱是Fas相關(guān)死亡域樣白介素－1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白 (fas－associated death domain like IL－1 beta converting enzyme inhibitory protein，F(xiàn)LIP)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞中FLIP蛋白過(guò)表達(dá)時(shí)，其凋亡過(guò)程受到抑制，腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)過(guò)度堆積，而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。因而FLIP與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)，其作用不可忽視［1］。NF－κB(nuclear factorkappa B)是一類廣泛存在于多種組織細(xì)胞中，具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子。屬于Rel家族成員，能將高等真核細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至核內(nèi)從而引起基因特殊位點(diǎn)表達(dá)。NF－κB過(guò)度激活與許多病理現(xiàn)象有關(guān)。其中在細(xì)胞增殖與凋亡中具有核心作用。除能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡外，還可具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，因此是一種雙向調(diào)節(jié)因子［2］。

上述兩種因子在骨肉瘤組織中的表達(dá)及相互關(guān)系的相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)尚不多見(jiàn)。本研究采用免疫組織化學(xué)方法來(lái)檢測(cè)FLIP、NF－κB蛋白在骨肉瘤中的表達(dá)，并采用TUNEL法檢測(cè)骨肉瘤中細(xì)胞凋亡程度，探討二者在骨肉瘤細(xì)胞增殖活性與凋亡中的相互關(guān)系，為骨肉瘤的基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本采集 石蠟標(biāo)本取自唐山市骨科醫(yī)院及唐山市人民醫(yī)院2002—2008年骨肉瘤手術(shù)石蠟標(biāo)本55例 (實(shí)驗(yàn)組)。其中男41例，女14例，年齡12～57歲，平均 (25.3±8.4)歲。同時(shí)收集同一醫(yī)院骨軟骨瘤石蠟標(biāo)本30例 (對(duì)照組)。選擇腫瘤實(shí)質(zhì)灰白色或灰紅色外觀區(qū)取材并進(jìn)行常規(guī)病理染色，請(qǐng)專業(yè)病理醫(yī)生確診，后進(jìn)行免疫組織化及細(xì)胞凋亡(TUNEL法)檢測(cè)。

1.2 試劑及檢測(cè)方法 免抗人FLIP多克隆抗體，工作濃度1∶100。免抗人NF－κB多克隆抗體，濃度1∶160。二抗兩步法免疫組織化學(xué)試劑盒 (即用型)、細(xì)胞凋亡 (TUNEL)檢測(cè)試劑盒。以上試劑均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司。

石蠟切片4～5μm，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組FLIP及NF－κB蛋白的表達(dá)強(qiáng)度應(yīng)用免疫組織化學(xué)兩步法檢測(cè)。應(yīng)用TUNEL法通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)骨肉瘤組及骨軟骨瘤組細(xì)胞凋亡。上述實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照以證明其準(zhǔn)確性。

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定 FLIP陽(yáng)性為腫瘤細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)褐色顆粒，NF－κB陽(yáng)性則細(xì)胞核出現(xiàn)褐色顆粒。結(jié)果統(tǒng)計(jì)以每例中每張切片觀察5個(gè)200倍視野 (×200)，對(duì)其中腫瘤細(xì)胞胞漿或胞核中陽(yáng)性表達(dá)的褐色顆粒進(jìn)行標(biāo)記，計(jì)數(shù)所有檢測(cè)視野中的陽(yáng)性顆粒。經(jīng)醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行平均光密度 (optical density，OD)檢測(cè)及分析［3］。

TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡:石蠟切片按TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明染色。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡并計(jì)算凋亡指數(shù) (AI)，即凋亡率計(jì)算方法:每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍 (×200倍)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞平均數(shù)，按公式計(jì)算凋亡率:細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn);將骨肉瘤組FLIP，NF－κB蛋白表達(dá)的強(qiáng)度 (OD值)與凋亡率進(jìn)行相關(guān)性分析，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FLIP和NF－κB蛋白在骨肉瘤中的表達(dá) 骨肉瘤組織中FLIP蛋白陽(yáng)性位于骨肉瘤及骨軟骨瘤細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕褐色 (見(jiàn)圖1);而NF－κB蛋白則位于細(xì)胞核 (見(jiàn)圖2)。骨肉瘤組織中陽(yáng)性細(xì)胞體積較大，核大，可見(jiàn)核分裂像，呈彌漫分布。骨肉瘤組中FLIP蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于骨軟骨瘤，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05)。NF－κB蛋白在骨肉瘤組織中表達(dá)強(qiáng)度高于骨軟骨瘤組織，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05，見(jiàn)表1)。

2.2 TUNEL檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞凋亡 通過(guò)TUNEL方法經(jīng)異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記，用激光共聚焦顯微鏡觀察，可見(jiàn)呈致密綠色熒光的凋亡細(xì)胞及凋亡小體 (見(jiàn)圖3);實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù) (17.586±0.817)%明顯低于對(duì)照組的 (32.524±1.601)% (t=32.372，p＜0.05)。

2.3 FLIP的表達(dá)與骨肉瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系 采用直線相關(guān)分析，F(xiàn)LIP表達(dá)與細(xì)胞凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān) (r=－0.949，p＜0.01)。NF－κB蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡指數(shù)亦呈負(fù)相關(guān) (r=－0.877，p＜0.01)。經(jīng)相關(guān)分析得出，二者表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.971，p＜0.01)。

表1 FLIP和NF－κB蛋白在骨肉瘤中的表達(dá) (x±s)Table 1 The expression of FLIP and NF－κB protein in osteosarcoma and osteochondroma groups

圖1 FLIP蛋白表達(dá)于骨肉瘤細(xì)胞質(zhì) (IHC，×200)Figure 1 Positive expression of FLIPprotein in the cytoplasm of osteosarcoma cells

圖2 NF－κB蛋白表達(dá)于骨肉瘤細(xì)胞核 (IHC，×200)Figure 2 Positive expression of NF－κB protein in the nucleus of osteosarcoma cells

圖3 凋亡細(xì)胞及凋亡小體呈致密綠色熒光 (圓圈處為綠色熒光處，TUNEL，×400)Figure 3 The green fluorescence was found in apoptotic cells and apoptotic bodies

3 討論

腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中凋亡失衡機(jī)制起著重要作用。腫瘤細(xì)胞可通過(guò)不同機(jī)制逃逸受體介導(dǎo)的凋亡，使其得以繼續(xù)生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞凋亡受抑是其發(fā)生、發(fā)展的標(biāo)志。因此凋亡抑制蛋白在腫瘤中過(guò)度表達(dá)已成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。設(shè)計(jì)藥物去誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡既可阻滯腫瘤細(xì)胞復(fù)制又可殺傷腫瘤細(xì)胞［4］。

凋亡抑制蛋白FLIP因能抑制Fas介導(dǎo)的凋亡，從而使腫瘤細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，在許多類型腫瘤細(xì)胞中均呈過(guò)度表達(dá)。此外，F(xiàn)LIP還能阻斷腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體 (TRAIL)、死亡受體 (DR4)等其他細(xì)胞表面死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因?yàn)樗鼈兊耐飞暇哂蠪ADD或Caspase－8的環(huán)節(jié)，F(xiàn)LIP的DED端可與之結(jié)合，阻止其后續(xù)環(huán)節(jié)，從而抑制凋亡［5－6］。

研究發(fā)現(xiàn)FLIP在惡性黑色素瘤、結(jié)腸癌、肺小細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、前列腺癌等多種人類腫瘤中均呈過(guò)表達(dá)狀態(tài);而對(duì)應(yīng)的正常組織或良性病變中，F(xiàn)LIP不表達(dá)或呈低水平表達(dá)。在一些對(duì)化療藥物有抵抗作用的惡性腫瘤中已發(fā)現(xiàn)有FLIP蛋白過(guò)表達(dá)。目前已經(jīng)研制出針對(duì)凋亡抑制蛋白的反義寡核苷酸和小分子抑制劑，現(xiàn)正處于早期臨床試用階段［7－8］。本研究免疫組化結(jié)果顯示:55例骨肉瘤中，F(xiàn)LIP蛋白表達(dá)的OD值明顯高于骨軟骨瘤，這與以往的文獻(xiàn)報(bào)道一致。說(shuō)明骨肉瘤的發(fā)生與FLIP蛋白高表達(dá)有直接關(guān)系，其機(jī)制可能是FLIP表達(dá)后與Caspase－8競(jìng)爭(zhēng)在DED上的結(jié)合位點(diǎn)，從而阻斷死亡受體 Fas、TNF－R1及 TRAIL介導(dǎo)的凋亡，使與Caspase－8相關(guān)的凋亡途徑受到抑制，甚至中斷。因此FLIP可能通過(guò)抑制癌細(xì)胞凋亡參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，F(xiàn)LIP具有抗凋亡作用并能在骨肉瘤的惡性進(jìn)展中起重要作用［9］。

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL技術(shù)，對(duì)55例骨肉瘤及30例骨軟骨瘤進(jìn)行了細(xì)胞凋亡檢測(cè)以探討腫瘤細(xì)胞凋亡與FLIP的關(guān)系。結(jié)果顯示:骨肉瘤組凋亡指數(shù)明顯低于骨軟骨瘤組。說(shuō)明雖然骨肉瘤及骨軟骨瘤均有細(xì)胞凋亡異常，但前者為分化差的惡性腫瘤，而后者為良性腫瘤，分化程度越低其凋亡的程度也越低。說(shuō)明細(xì)胞凋亡通路受癌基因過(guò)度表達(dá)而受到抑制，相反，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖則成反比。一旦凋亡、增殖平衡被打破，機(jī)體不能及時(shí)清除惡變的腫瘤細(xì)胞，則以腫瘤細(xì)胞的增殖為主，惡性腫瘤發(fā)展迅速［10］。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)又檢測(cè)了骨肉瘤中FLIP蛋白表達(dá)與其細(xì)胞凋亡的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn):FLIP蛋白表達(dá)與骨肉瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)之間存在負(fù)相關(guān)。

NF－κB是廣泛存在于各種細(xì)胞中的具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的核蛋白因子，參與機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控、腫瘤發(fā)生及細(xì)胞凋亡等。能與多種細(xì)胞基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中的κB序列位點(diǎn)特異性結(jié)合，上調(diào)轉(zhuǎn)錄活性，其可以調(diào)控一些細(xì)胞凋亡相關(guān)基因如FLIP基因、p53基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而明顯提高腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力。因c－FLIP基因編碼序列中存在κB位點(diǎn)，故腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的NF－κB蛋白能上調(diào)FLIP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞逃避Fas、TRAIL介導(dǎo)的凋亡信號(hào)的調(diào)控。此外NF－κB不僅參與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，還能通過(guò)腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的平衡失調(diào)參與惡性腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移［11］。無(wú)論是良性增生性病變還是惡性腫瘤的發(fā)生，所導(dǎo)致的NF－kB活化，其主要作用都是抑制細(xì)胞凋亡，故在一般情況下，NF－kB均被認(rèn)為是凋亡抑制因子，在惡性腫瘤中均呈明顯高表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示:骨肉瘤組織中NF－κB蛋白陽(yáng)性明顯高于骨軟骨瘤。表明骨肉瘤增殖速度高于骨軟骨瘤且說(shuō)明NF－κB的表達(dá)強(qiáng)度影響腫瘤的良惡性程度。關(guān)于NF－κB致癌機(jī)制，目前傾向于通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因或誘導(dǎo)TRAF(TNF受體相關(guān)因子)和IAP(凋亡抑制蛋白)而拮抗凋亡，亦可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖或通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［12－13］。本研究也發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中存在NF－κB表達(dá)增強(qiáng)，且細(xì)胞核內(nèi)有強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)，說(shuō)明NF－κB在核內(nèi)存在活化，提示NF－κB在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。

關(guān)于FLIP與NF－κB蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)及相互關(guān)系的相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)尚少見(jiàn)。相關(guān)研究認(rèn)為，NF－κB的異常表達(dá)與活化可以誘導(dǎo)FLIP的表達(dá)，而FLIP在NF－κB發(fā)揮抗凋亡過(guò)程中起著重要作用。Okano等［14］在進(jìn)行肝細(xì)胞癌的相關(guān)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，c－FLIP的過(guò)度表達(dá)可激活NF－κB，而c－FLIP表達(dá)下調(diào)時(shí)能減弱TNF－α等誘導(dǎo)的NF－κB的活化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織FLIP與NF－κB表達(dá)之間存在著一定的正相關(guān)關(guān)系，表明兩者在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中存在促進(jìn)作用，共同參與骨肉瘤的形成。

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