羅 君，朱路平，李東麗

破傷風(fēng)是由破傷風(fēng)桿菌 (clostridium tetani)侵入傷口生長繁殖產(chǎn)生毒素而引起的一種急性特異性感染。破傷風(fēng)可在任何年齡發(fā)病，病死率高。為了解0～7歲兒童破傷風(fēng)疫苗全程足量免疫后抗體水平，本研究收集了鄭州市262份0～7歲基礎(chǔ)免疫兒童血清樣品，用國內(nèi)和國外兩種酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)試劑盒進(jìn)行破傷風(fēng)IgG抗體定量檢測，并且評價破傷風(fēng)IgG ELISA試劑的檢測效率和可靠性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2010年8月—2011年3月鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院0～7歲基礎(chǔ)免疫兒童血清樣本262份，其中男140份，女122份。檢測前所有標(biāo)本－20℃保存。

1.2 樣本采集

1.2.1 免疫程序 根據(jù)我國2005年《預(yù)防接種工作規(guī)范》中規(guī)定［1］，百白破疫苗為國家免疫規(guī)劃中基礎(chǔ)免疫疫苗，常規(guī)免疫程序為百白破疫苗接種5劑次，前3劑次為基礎(chǔ)免疫，第4劑次為加強(qiáng)免疫，第5劑次使用疫苗加強(qiáng)免疫1劑次。新生兒出生后3個月開始接種百白破疫苗第1針，連續(xù)接種3針，每針間隔時間最短不得少于28 d，在1歲半至2周歲時再用百白破疫苗加強(qiáng)免疫1針，7周歲時用精制白喉疫苗或精制白破二聯(lián)疫苗加強(qiáng)免疫1針。

1.2.2 樣本采集 262份血清樣本抽樣采集于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院的基礎(chǔ)免疫兒童，包括未接種疫苗的新生兒樣本，及接種疫苗后不同年齡段樣本，抽取的樣本待自然凝固后高速離心，取上層血清于1.5 ml試管中冷凍備檢，并編號。

1.3 檢測試劑 使用兩種檢測試劑盒，分別是鄭州市安圖綠科生物工程有限公司生產(chǎn)的破傷風(fēng)毒素IgG抗體定量檢測試劑盒 (批號:20101001，簡稱“安圖試劑”)和德國MPBiomedicals Germany GmbH生產(chǎn)的獲得CE注冊的破傷風(fēng)類毒素IgG抗體檢測試劑盒 (批號:TT－204，簡稱“MP試劑”)。

1.4 檢測方法 ELISA間接法檢測。將血清1∶100稀釋后加入包被有破傷風(fēng)類毒素的96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，按照操作程序顯色后450 nm下讀取吸光度 (A)值。使用定量試劑盒提供的含量為0.1、0.2、0.4、0.8和2.0 U/ml的標(biāo)準(zhǔn)血清繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，根據(jù)樣品A值計算出IgG抗體含量(U/ml);同時以0.1 U/ml標(biāo)準(zhǔn)血清對應(yīng)的A值為臨界值(Cutoff)，確定IgG抗體的陰性或陽性。262份兒童血清樣本用兩種試劑盒進(jìn)行平行檢測，試驗中加樣試劑和洗板步驟分別由固定2人分工完成，試驗過程嚴(yán)格按試劑盒推薦步驟操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)免疫兒童血清破傷風(fēng)IgG抗體水平 262份樣本中，“MP試劑”檢出結(jié)果IgG抗體陽性154份，陽性率為58.78%;“安圖試劑”檢出結(jié)果IgG抗體陽性146份，陽性率為55.73%。兩種試劑盒的檢測陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=1.45，P=0.227，見表1)。

表1 兒童血清破傷風(fēng)IgG抗體水平Table 1 Tetanus antibodies level of children with fundamental immunity

2.2 不同年齡段兒童血清破傷風(fēng)IgG抗體水平 兩種試劑盒檢測的不同年齡段兒童血清破傷風(fēng)IgG抗體水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表2)。且不同年齡段的基礎(chǔ)免疫兒童的破傷風(fēng)保護(hù)率達(dá)到了《計劃免疫管理規(guī)程》的相關(guān)規(guī)定。

3 討論

破傷風(fēng)是危險性很高的感染性疾病，人體內(nèi)破傷風(fēng)IgG抗體的存在主要有兩個來源:一是新生兒由母親體內(nèi)傳遞來的或普通人群通過被動免疫獲得，二是注射免疫后獲得。接種破傷風(fēng)疫苗是有效的預(yù)防手段，因此，我國一直把百白破疫苗列為基礎(chǔ)免疫疫苗，常規(guī)免疫程序為5劑次，首針接種時間為出生后3個月的嬰兒。了解人群特別是基礎(chǔ)免疫兒童的破傷風(fēng)保護(hù)抗體水平很有必要。

ELISA法檢測因其具有快速、敏感、特異、簡便、結(jié)果容易判定等特點，最近幾年被廣泛用于人血清中細(xì)菌抗體水平的檢測。有實驗表明，ELISA法檢測血清破傷風(fēng)IgG抗體的靈敏度可達(dá)到0.004 U/ml［2］。采用間接 ELISA 法檢測百日咳、白喉和破傷風(fēng)抗體，在敏感性、快速性和結(jié)果客觀性及可操作性等方面均優(yōu)于間接血凝法，是代替?zhèn)鹘y(tǒng)的小鼠中和試驗法的有效辦法。

不同地區(qū)、不同種族的人群機(jī)體中破傷風(fēng)IgG抗體與試劑盒的反應(yīng)性強(qiáng)弱存在差異，各實驗室應(yīng)根據(jù)自己實際條件及接觸人群建立正常參考值。世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為，ELISA法檢測時，血清中的中和抗體≥0.1 U/ml才被認(rèn)為是陽性，該標(biāo)準(zhǔn)為人破傷風(fēng)抗毒素血漿的篩查工作，和百白破疫苗全程免疫后人體破傷風(fēng)抗毒素水平的檢測提供了重要參考依據(jù)。

表2 基礎(chǔ)免疫不同年齡段兒童血清破傷風(fēng)IgG抗體水平Table 2 Tetanus antibodies level in different age children with fundamental immunity

本次抽樣采集的262份0～7歲基礎(chǔ)免疫兒童血清樣品，分別用“安圖試劑盒”和“MP試劑盒”檢測破傷風(fēng)IgG抗體，在實驗結(jié)果判定時，依據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)，確定0.1 U/ml作為破傷風(fēng)抗體最低保護(hù)濃度。檢測結(jié)果抗體陽性率分別為55.73%和58.78% ，兩種試劑盒檢測結(jié)果無差異。有資料報道，1～14歲兒童破傷風(fēng)IgG抗體達(dá)到保護(hù)水平 (≥0.1 U/ml)的比例可達(dá)到94.55%［3］，而本研究結(jié)果顯示鄭州市0～7歲基礎(chǔ)免疫兒童破傷風(fēng)IgG抗體保護(hù)率僅達(dá)到55%左右，此結(jié)果提示今后加強(qiáng)兒童百白破三聯(lián)疫苗注射的必要性。

根據(jù)衛(wèi)生部《計劃免疫管理規(guī)程》要求，新生兒出生后3個足月開始接種百白破疫苗第1針，說明該人群為破傷風(fēng)易感人群。此次的檢測結(jié)果均顯示，＜3個月新生兒破傷風(fēng)的保護(hù)率在30%以內(nèi)，這與文獻(xiàn)報道“新生兒出生時具有與母親相同或稍高的破傷風(fēng)抗體的滴度，從而可使新生兒短暫獲得對破傷風(fēng)的被動免疫保護(hù)”相符［4］;同時，檢測結(jié)果也反映出兒童在未免疫的低月齡 (1～2個月)內(nèi)最易發(fā)病的實際情況。有關(guān)文獻(xiàn)建議將免疫程序中的百白破疫苗初免月齡由3個月齡提前到2個月齡，與國際上許多國家一致［5］。

檢測結(jié)果中39名3個月齡兒童的破傷風(fēng)抗體保護(hù)率僅為15%左右，提示3個月左右未接種破傷風(fēng)疫苗的嬰兒自身抗體水平較低，體內(nèi)并不存在來自于母體的抗百日咳、抗白喉、抗破傷風(fēng)的三種特異抗體，完全不足以抵抗三種疾病的侵襲，使得未免疫嬰兒3個月齡內(nèi)患百日咳、白喉、破傷風(fēng)的危險性增加。

本研究中，34名4～6個月新生兒，均為破傷風(fēng)疫苗連續(xù)接種3針，完成了百白破疫苗的基礎(chǔ)免疫。檢測結(jié)果顯示，破傷風(fēng)抗體保護(hù)率達(dá)到82.29%，達(dá)到了《計劃免疫管理規(guī)程》規(guī)定的＞75.0%的要求;54名6～18個月兒童的破傷風(fēng)的保護(hù)率也達(dá)到80%以上，與4～6個月的新生兒相比，破傷風(fēng)抗體濃度基本持平。《計劃免疫管理規(guī)程》規(guī)定，新生兒在1歲半至2周歲時再用百白破疫苗加強(qiáng)免疫1針，6周歲時用精制白喉疫苗或精制白破二聯(lián)疫苗加強(qiáng)免疫1針。本研究結(jié)果顯示，＞1.5歲的新生兒，破傷風(fēng)的保護(hù)率均為85%左右，與6～18個月兒童相比，破傷風(fēng)保護(hù)率又有所提高，達(dá)到了《計劃免疫管理規(guī)程》規(guī)定的＞75.0%的要求。

本研究結(jié)果提示，本地區(qū)0～7歲基礎(chǔ)免疫兒童血清破傷風(fēng)IgG抗體保護(hù)率較低，加強(qiáng)人群破傷風(fēng)類毒素免疫很有必要。3個足月的新生兒應(yīng)及時按照規(guī)范要求，全程接種百白破疫苗，并按照規(guī)定接種加強(qiáng)針，以維持體內(nèi)足夠的抗體水平。

1 衛(wèi)生部.預(yù)防接種工作規(guī)范［R］.衛(wèi)疾控發(fā)〔2005〕373號.

2 郭立君，邵華，楊麗華，等.破傷風(fēng)抗體IgG酶聯(lián)檢測試劑盒的研制 ［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2003，16(4):225－226.

3 沈月根，姜霞玲，顧謝君.嘉興市秀洲區(qū)健康人群百日咳、白喉、破傷風(fēng)抗體水平監(jiān)測 ［J］.中國計劃免疫，2004，10(1):37.

4 孫月平.對育齡婦女破傷風(fēng)免疫狀況的分析［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007，23(2):175.

5 侯啟明.不同區(qū)域嬰兒抗百日咳、白喉、破傷風(fēng)母體抗體水平的調(diào)查 ［J］.中國計劃免疫，2006，12(3):209－211.