姚舒洋,樊 英,徐兵河
三陰性乳腺癌 (triple-negative breast cancer,TNBC)即雌激素受體 (ER)、孕激素受體 (PR)和人表皮生長因子受體2(HER2)均表達為陰性,約占新診斷乳腺癌的15%。這類疾病具有相似的特征、極高的同源性,組織分化差,多屬于基底樣乳腺癌,與乳腺癌1號基因 (BRCA1)相關(guān)性乳腺癌具有較多相似性[1-2]。TNBC患者發(fā)病年齡早,易早期局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移,增殖指數(shù)高[3-4],無病生存時間和總生存時間均較短,預后不佳,目前國內(nèi)外仍缺乏針對該特殊類型乳腺癌的規(guī)范化治療指南。雖然TNBC缺乏內(nèi)分泌治療和抗HER2治療的靶點,然而其他分子靶向藥物正在進行體內(nèi)外治療研究[5]。目前單藥索拉非尼對TNBC細胞體外抑制作用的研究不多,且尚無分子靶向藥物聯(lián)合順鉑 (DDP)體外治療TNBC的報道。因而本研究觀察DDP聯(lián)合索拉非尼對TNBC細胞的抑制作用,探索治療TNBC的新思路。
1.1 材料 選用人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDAMB-468、CAL-51于本實驗室保存。培養(yǎng)傳代在含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,選擇指數(shù)生長期細胞進行實驗。索拉非尼 (德國拜耳公司)溶解于二甲基亞砜 (DMSO)制成濃度為10 mM的溶液,分裝保存于-20℃冰箱備用,加藥時用DMEM培養(yǎng)基稀釋至目標濃度,使終溶液中的DMSO濃度<0.5%。DDP購自山東齊魯制藥廠,DMEM購自GIBCO公司,MTT購自 Sigma公司,Anti-ERK1/2、Anti-p-ERK1/2、Anti-β-Actin、Anti-JNK、Anti-p-JNK購自Santa Cruz Biotechnology公司,Anti-Rabbit及Anti-Mouse購自Promega公司。
1.2 實驗分組 實驗細胞分為空白對照組、索拉非尼單藥組、DDP單藥組、DDP聯(lián)合索拉非尼組。檢測細胞增殖抑制率時DDP單藥劑量分別為5、10、50、100 M,索拉非尼單藥劑量分別為1、2、5、10 M,DDP聯(lián)合索拉非尼組藥物劑量是4+2、8+4、10+5、12+6、14+7 M。檢測MAPK通路關(guān)鍵蛋白時,各組中索拉非尼劑量均為5 M,DDP劑量均為10 M。
1.3 MTT法檢測細胞生長抑制率 MDA-MB-231、MDAMB-468、CAL-51細胞接種在96孔培養(yǎng)板中,每孔接種5 000細胞,設(shè)3個平行孔。培養(yǎng)24 h后加入藥物。加入不同劑量的DDP,或 (和)索拉非尼繼續(xù)培養(yǎng)48 h,傾去培養(yǎng)基,加入用無血清DMEM培養(yǎng)基配制的0.5 g/ml MTT 100μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄培養(yǎng)基,然后加入DMSO 200μl,搖床20 min,充分溶解后,立即用酶標儀測定吸光度 (OD)值,計算細胞增殖抑制率。腫瘤細胞生長抑制率=1-〔該藥物處理組平均A值-空白對照組A值〕/〔細胞對照組平均A值 (陰性對照) -空白對照組A值〕×100%。實驗重復3次。采用各組抑制率均數(shù),經(jīng)生物軟件CalcuSyn計算不同藥物作用48 h的半數(shù)抑制濃度 (IC50)、兩藥聯(lián)用時IC50的變化以及不同濃度的兩藥聯(lián)合作用于各種細胞的協(xié)同系數(shù) (combination index,CI)。CI>1為拮抗作用,CI=1為相加作用,CI<1為協(xié)同作用,且CI值越小,表示藥物協(xié)同效應越強。
1.4 Western blot分析 Anti-ERK1/2、Anti-p-ERK1/2、Anti-β-Actin、Anti-JNK、Anti-p-JNK蛋白表達 取生長狀態(tài)良好的細胞,待細胞密度達到60%~70%,分別加培養(yǎng)基,10μM DDP,5μM索拉非尼,以及10μM DDP聯(lián)合5μM索拉非尼作用48 h,收集培養(yǎng)液。刮取細胞于試管中,3 000 r/min離心5 min,收集細胞于Ep管中,加入適量蛋白裂解液,離心20 min,取上清-70℃?zhèn)溆谩悠奉A先用Bradford法定量,每孔上樣50μg總蛋白于12%分離膠和5%濃縮膠SDS-PAGE凝膠電泳;蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜;室溫下5%牛奶封閉1 h,一抗 (Anti-ERK1/2、Anti-p-ERK1/2、Anti-β-Actin、Anti-JNK、Anti-p-JNK,按1∶1 000稀釋)4℃過夜,二抗 (Anti-Rabbit及Anti-Mouse,按1∶2 000稀釋) 室溫下孵育1 h,曝光,顯影,定影。
1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以 ()表示,多組間比較采用方差分析,組間兩兩比較采用q檢驗,以p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 不同劑量的DDP、索拉非尼和DDP聯(lián)合索拉非尼對各細胞株生長抑制率比較 MTT法檢測不同劑量的DDP對MDAMB-231、MDA-MB-468、CAL-51細胞株生長抑制率比較,差異均有統(tǒng)計學意義 (p<0.05)。DDP對各細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性,隨劑量的增加,其對細胞增殖的抑制作用逐漸增強,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義 (p<0.05)。同一濃度藥物作用下各細胞株生長抑制率比較,差異均有統(tǒng)計學意義 (p<0.05,見表1)。
不同劑量索拉非尼對MDA-MB-231、MDA-MB-468、CAL-51細胞株生長抑制率比較,差異均有統(tǒng)計學意義 (p<0.05)。索拉非尼對各細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性,隨劑量增加,其對細胞增殖的抑制作用逐漸增強,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義 (p<0.05)。MDA-MB-231、MDAMB-468、CAL-51細胞株在索拉非尼1 M和10 M時的生長抑制率比較,差異均無統(tǒng)計學意義 (P>0.05);在2 M和5 M時的生長抑制率比較,差異均有統(tǒng)計學意義 (p<0.05,見表2)。
表1 不同劑量DDP對各細胞株生長抑制率比較 (,%)Table 1 Inhibitory effects of DDPof different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines
表1 不同劑量DDP對各細胞株生長抑制率比較 (,%)Table 1 Inhibitory effects of DDPof different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines
濃度(M)例數(shù)MDA-MB-231 MDA-MB-468 CAL-51 F值P值5 3 19.9±8.7 56.1±5.5 38.6±5.5 21.578 0.002 10 3 34.8±6.9 82.2±2.6 48.2±9.0 44.536 0.000 50 3 54.8±8.9 90.3±3.8 73.5±9.3 15.850 0.004 100 3 74.6±0.8 92.3±3.7 86.3±1.8 40.661 0.000 F 35.298 50.804 29.002 P值值0.000 0.000 0.000
表2 不同劑量索拉非尼對各細胞株生長抑制率比較 (,%)Table 2 Inhibitory effects of Sorafenib of different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines
表2 不同劑量索拉非尼對各細胞株生長抑制率比較 (,%)Table 2 Inhibitory effects of Sorafenib of different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines
濃度(M)例數(shù)MDA-MB-231 MDA-MB-468 CAL-51 F值P值1 3 6.5±1.2 5.1± 1.8 7.4±2.8 0.935 0.443 2 3 15.9±1.0 13.7± 0.7 22.1±3.0 16.155 0.004 5 3 22.1±5.3 44.6± 4.3 38.4±4.5 18.273 0.003 10 3 71.1±2.1 77.8±14.9 82.5±1.8 1.287 0.343 F 287.493 53.376 316.906 P值值0.000 0.000 0.000
不同劑量DDP聯(lián)合索拉非尼對MDA-MB-231、MDAMB-468、CAL-51細胞株生長抑制率比較,差異均有統(tǒng)計學意義 (P=0.000)。DDP聯(lián)合索拉非尼對各細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性,隨劑量增加,其對細胞增殖的抑制作用逐漸增強,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義 (P=0.000)。在同一濃度藥物作用下各細胞株生長抑制率比較,差異均有統(tǒng)計學意義 (p<0.05,見表3)。
2.2 不同劑量的DDP和索拉非尼對不同乳腺癌細胞株的CI按照藥物協(xié)同作用中效原理,利用CalcuSyn軟件計算得出的藥物作用48 h不同劑量的DDP和索拉非尼的CI值均<1(見表4)。
2.3 不同組MAPK關(guān)鍵蛋白的表達情況 經(jīng)DDP單藥處理48 h后的各細胞的ERK、p-ERK、JNK的表達較空白對照組無明顯不同;索拉非尼單藥和聯(lián)合DDP處理48 h后的各細胞p-ERK的表達明顯受到抑制;DDP單藥處理48 h后MDAMB-231和MDA-MB-468細胞的p-JNK表達較空白對照組明顯升高,但p-JNK表達不如索拉非尼單藥和聯(lián)合DDP處理后升高明顯,且聯(lián)合組的表達量明顯大于兩個單藥組。索拉非尼單藥或聯(lián)合DDP處理48 h后CAL-51細胞的p-JNK表達亦明顯升高,但索拉非尼單藥和聯(lián)合DDP處理后p-JNK的表達沒有明顯不同 (見圖1)。
表3 不同劑量DDP聯(lián)合索拉非尼對各細胞株生長抑制率比較,%)Table 3 Inhibitory effects of DDPcombined with Sorafenib of different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines
表3 不同劑量DDP聯(lián)合索拉非尼對各細胞株生長抑制率比較,%)Table 3 Inhibitory effects of DDPcombined with Sorafenib of different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines
濃度(M)例數(shù) MDA-MB-231 MDA-MB-468 CAL-51 F值 P值4+2 3 13.3±1.8 63.3±1.1 63.3±2.3 789.075 0.000 8+4 3 35.0±0.5 73.5±1.9 77.4±0.9 973.047 0.000 10+5 3 47.2±1.6 79.0±1.5 84.7±0.9 643.047 0.000 12+6 3 57.2±1.6 81.1±0.4 87.4±1.8 368.377 0.000 14+7 3 61.3±1.9 87.8±3.2 93.3±1.1 178.638 0.000 F 458.280 73.351 172.469 P值值0.000 0.000 0.000
表4 不同劑量的DDP和索拉非尼對不同乳腺癌細胞株的CITable 4 Combination index(CI)of different concentrations of DDP andSorafenib on four kinds of breast cancer cell lines
圖1 索拉非尼或 (和)DDP作用MDA-MB-231,MDA-MB-468和CAL-51細胞48 h后,對MAPK信號通路蛋白的影響Figure 1 Effect on MAPK signaling pathway proteins 48 h after application of Sorafenib or/and cisplatin on MDA-MB-231,MDA-MB-468 and CAL-51 cells
TNBC是乳腺癌中最富有挑戰(zhàn)性的,目前最主要的治療措施仍為全身化療,但其預后依然很差。索拉非尼是一種口服的多激酶抑制劑,能抑制RAF、c-KIT、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-、FLT3等激酶的活性[6]。在多種腫瘤包括肝癌[7]、甲狀腺癌[8]、胃腸間質(zhì)瘤[9]的臨床研究中均顯示出確切的抗腫瘤增殖的活性。DDP是一種類烷化劑的金屬鉑類化合物,BRCA1相關(guān)性乳腺癌對鉑類藥物相當敏感。本研究首次進行了索拉非尼單藥或 (和)聯(lián)合DDP體外治療TNBC的研究。MTT結(jié)果表明DDP與索拉非尼單藥對3種TNBC細胞株的體外生長均有抑制作用,且抑制率隨著藥物劑量增加而增加,具有劑量效應依賴關(guān)系。這表明兩藥聯(lián)用達到對乳腺癌細胞同樣的抑制作用時所需藥物劑量較其單獨應用時極大降低,這對于臨床用藥時降低藥物劑量,減少毒副作用具有重要的意義。因此,本研究MTT結(jié)果支持了生物化療這一腫瘤治療新模式的先進性,聯(lián)合用藥取得了更好的腫瘤細胞增殖抑制作用。與單藥相比,聯(lián)合用藥進一步提高了療效,而且減少各單藥的用藥劑量,因而可能減少藥物的毒副作用,提高耐受性。
經(jīng)10多年對DDP與MAPK信號途徑的研究認為,MAPK是細胞對DDP反應的重要調(diào)節(jié)因素。JNK活化可以增強細胞對DDP的敏感性,減輕DDP的耐藥性[10-11]。本研究中僅發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細胞DDP單藥組p-JNK表達較對照組明顯升高,而ERK、p-ERK和JNK的表達較對照組無明顯變化;3種細胞經(jīng)DDP單藥處理48 h后ERK、p-ERK、JNK和p-JNK的表達較對照組均無明顯變化。DDP單藥對MDAMB-468和CAL-51細胞的抑制作用可能不是通過影響ERK和JNK通路起作用。在聯(lián)合用藥中發(fā)現(xiàn),DDP能協(xié)同增強索拉非尼對JNK的磷酸化,這說明DDP能協(xié)同增強索拉非尼對JNK通路的激活,從而進一步誘導凋亡。MDA-MB-468細胞的聯(lián)合用藥組p-ERK明顯低于索拉非尼單藥組,說明DDP能協(xié)同抑制ERK的磷酸化,抑制ERK通路的活性,從而抑制細胞的增殖。但是在其他細胞的聯(lián)合組中沒有觀察到DDP聯(lián)合索拉非尼對ERK通路有協(xié)同抑制作用。
Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn),索拉非尼通過抑制人肝癌細胞株HepG2的RAF/ERK通路,使MEK和ERK的磷酸化水平下降,下調(diào)CyclinDl,使增殖期細胞不能通過“G1-S”調(diào)節(jié)點,影響細胞增殖促進凋亡。Wei等[12]研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼聯(lián)合維生素K能在體外通過抑制p-ERK和Bcl-2的表達,增加p-JNK、c-Jun和FALS的表達,促進胰腺癌細胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼單藥和聯(lián)合DDP處理各細胞株,均能見到p-ERK的表達較空白對照組和DDP單藥組明顯降低,p-JNK的表達明顯升高。只在MDA-MB-468細胞的聯(lián)合用藥組發(fā)現(xiàn),p-ERK的表達明顯低于索拉非尼單藥組。原因可能是索拉非尼單藥對ERK通路的抑制能力太強,使p-ERK明顯減低,而使DDP協(xié)同索拉非尼抑制ERK的表達作用無法顯現(xiàn),可能降低索拉非尼的劑量能更好觀察二者的協(xié)同作用。因此,ERK通路抑制及JNK通路的激活是兩藥聯(lián)合增效的部分機制。
本研究的意義在于首次發(fā)現(xiàn)DDP聯(lián)合索拉非尼在體外能協(xié)同抑制多種TNBC細胞株的增殖,并初步闡明分子機制,為該方案的臨床應用提供了理論依據(jù)。
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