姚舒洋，樊 英，徐兵河

三陰性乳腺癌 (triple－negative breast cancer，TNBC)即雌激素受體 (ER)、孕激素受體 (PR)和人表皮生長因子受體2(HER2)均表達(dá)為陰性，約占新診斷乳腺癌的15%。這類疾病具有相似的特征、極高的同源性，組織分化差，多屬于基底樣乳腺癌，與乳腺癌1號(hào)基因 (BRCA1)相關(guān)性乳腺癌具有較多相似性［1－2］。TNBC患者發(fā)病年齡早，易早期局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，增殖指數(shù)高［3－4］，無病生存時(shí)間和總生存時(shí)間均較短，預(yù)后不佳，目前國內(nèi)外仍缺乏針對(duì)該特殊類型乳腺癌的規(guī)范化治療指南。雖然TNBC缺乏內(nèi)分泌治療和抗HER2治療的靶點(diǎn)，然而其他分子靶向藥物正在進(jìn)行體內(nèi)外治療研究［5］。目前單藥索拉非尼對(duì)TNBC細(xì)胞體外抑制作用的研究不多，且尚無分子靶向藥物聯(lián)合順鉑 (DDP)體外治療TNBC的報(bào)道。因而本研究觀察DDP聯(lián)合索拉非尼對(duì)TNBC細(xì)胞的抑制作用，探索治療TNBC的新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 選用人乳腺癌細(xì)胞株MDA－MB－231、MDAMB－468、CAL－51于本實(shí)驗(yàn)室保存。培養(yǎng)傳代在含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，選擇指數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。索拉非尼 (德國拜耳公司)溶解于二甲基亞砜 (DMSO)制成濃度為10 mM的溶液，分裝保存于－20℃冰箱備用，加藥時(shí)用DMEM培養(yǎng)基稀釋至目標(biāo)濃度，使終溶液中的DMSO濃度＜0.5%。DDP購自山東齊魯制藥廠，DMEM購自GIBCO公司，MTT購自 Sigma公司，Anti－ERK1/2、Anti－p－ERK1/2、Anti－β－Actin、Anti－JNK、Anti－p－JNK購自Santa Cruz Biotechnology公司，Anti－Rabbit及Anti－Mouse購自Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為空白對(duì)照組、索拉非尼單藥組、DDP單藥組、DDP聯(lián)合索拉非尼組。檢測細(xì)胞增殖抑制率時(shí)DDP單藥劑量分別為5、10、50、100 M，索拉非尼單藥劑量分別為1、2、5、10 M，DDP聯(lián)合索拉非尼組藥物劑量是4+2、8+4、10+5、12+6、14+7 M。檢測MAPK通路關(guān)鍵蛋白時(shí)，各組中索拉非尼劑量均為5 M，DDP劑量均為10 M。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率 MDA－MB－231、MDAMB－468、CAL－51細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種5 000細(xì)胞，設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)24 h后加入藥物。加入不同劑量的DDP，或 (和)索拉非尼繼續(xù)培養(yǎng)48 h，傾去培養(yǎng)基，加入用無血清DMEM培養(yǎng)基配制的0.5 g/ml MTT 100μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，然后加入DMSO 200μl，搖床20 min，充分溶解后，立即用酶標(biāo)儀測定吸光度 (OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。腫瘤細(xì)胞生長抑制率=1－〔該藥物處理組平均A值－空白對(duì)照組A值〕/〔細(xì)胞對(duì)照組平均A值 (陰性對(duì)照) －空白對(duì)照組A值〕×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用各組抑制率均數(shù)，經(jīng)生物軟件CalcuSyn計(jì)算不同藥物作用48 h的半數(shù)抑制濃度 (IC50)、兩藥聯(lián)用時(shí)IC50的變化以及不同濃度的兩藥聯(lián)合作用于各種細(xì)胞的協(xié)同系數(shù) (combination index，CI)。CI＞1為拮抗作用，CI=1為相加作用，CI＜1為協(xié)同作用，且CI值越小，表示藥物協(xié)同效應(yīng)越強(qiáng)。

1.4 Western blot分析 Anti－ERK1/2、Anti－p－ERK1/2、Anti－β－Actin、Anti－JNK、Anti－p－JNK蛋白表達(dá) 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%，分別加培養(yǎng)基，10μM DDP，5μM索拉非尼，以及10μM DDP聯(lián)合5μM索拉非尼作用48 h，收集培養(yǎng)液。刮取細(xì)胞于試管中，3 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞于Ep管中，加入適量蛋白裂解液，離心20 min，取上清－70℃?zhèn)溆?。樣品預(yù)先用Bradford法定量，每孔上樣50μg總蛋白于12%分離膠和5%濃縮膠SDS－PAGE凝膠電泳;蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜;室溫下5%牛奶封閉1 h，一抗 (Anti－ERK1/2、Anti－p－ERK1/2、Anti－β－Actin、Anti－JNK、Anti－p－JNK，按1∶1 000稀釋)4℃過夜，二抗 (Anti－Rabbit及Anti－Mouse，按1∶2 000稀釋) 室溫下孵育1 h，曝光，顯影，定影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以 ()表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量的DDP、索拉非尼和DDP聯(lián)合索拉非尼對(duì)各細(xì)胞株生長抑制率比較 MTT法檢測不同劑量的DDP對(duì)MDAMB－231、MDA－MB－468、CAL－51細(xì)胞株生長抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05)。DDP對(duì)各細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，隨劑量的增加，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05)。同一濃度藥物作用下各細(xì)胞株生長抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05，見表1)。

不同劑量索拉非尼對(duì)MDA－MB－231、MDA－MB－468、CAL－51細(xì)胞株生長抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05)。索拉非尼對(duì)各細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，隨劑量增加，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05)。MDA－MB－231、MDAMB－468、CAL－51細(xì)胞株在索拉非尼1 M和10 M時(shí)的生長抑制率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);在2 M和5 M時(shí)的生長抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05，見表2)。

表1 不同劑量DDP對(duì)各細(xì)胞株生長抑制率比較 (，%)Table 1 Inhibitory effects of DDPof different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines

表1 不同劑量DDP對(duì)各細(xì)胞株生長抑制率比較 (，%)Table 1 Inhibitory effects of DDPof different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines

濃度(M)例數(shù)MDA－MB－231 MDA－MB－468 CAL－51 F值P值5 3 19.9±8.7 56.1±5.5 38.6±5.5 21.578 0.002 10 3 34.8±6.9 82.2±2.6 48.2±9.0 44.536 0.000 50 3 54.8±8.9 90.3±3.8 73.5±9.3 15.850 0.004 100 3 74.6±0.8 92.3±3.7 86.3±1.8 40.661 0.000 F 35.298 50.804 29.002 P值值0.000 0.000 0.000

表2 不同劑量索拉非尼對(duì)各細(xì)胞株生長抑制率比較 (，%)Table 2 Inhibitory effects of Sorafenib of different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines

表2 不同劑量索拉非尼對(duì)各細(xì)胞株生長抑制率比較 (，%)Table 2 Inhibitory effects of Sorafenib of different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines

濃度(M)例數(shù)MDA－MB－231 MDA－MB－468 CAL－51 F值P值1 3 6.5±1.2 5.1± 1.8 7.4±2.8 0.935 0.443 2 3 15.9±1.0 13.7± 0.7 22.1±3.0 16.155 0.004 5 3 22.1±5.3 44.6± 4.3 38.4±4.5 18.273 0.003 10 3 71.1±2.1 77.8±14.9 82.5±1.8 1.287 0.343 F 287.493 53.376 316.906 P值值0.000 0.000 0.000

不同劑量DDP聯(lián)合索拉非尼對(duì)MDA－MB－231、MDAMB－468、CAL－51細(xì)胞株生長抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.000)。DDP聯(lián)合索拉非尼對(duì)各細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，隨劑量增加，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.000)。在同一濃度藥物作用下各細(xì)胞株生長抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05，見表3)。

2.2 不同劑量的DDP和索拉非尼對(duì)不同乳腺癌細(xì)胞株的CI按照藥物協(xié)同作用中效原理，利用CalcuSyn軟件計(jì)算得出的藥物作用48 h不同劑量的DDP和索拉非尼的CI值均＜1(見表4)。

2.3 不同組MAPK關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況 經(jīng)DDP單藥處理48 h后的各細(xì)胞的ERK、p－ERK、JNK的表達(dá)較空白對(duì)照組無明顯不同;索拉非尼單藥和聯(lián)合DDP處理48 h后的各細(xì)胞p－ERK的表達(dá)明顯受到抑制;DDP單藥處理48 h后MDAMB－231和MDA－MB－468細(xì)胞的p－JNK表達(dá)較空白對(duì)照組明顯升高，但p－JNK表達(dá)不如索拉非尼單藥和聯(lián)合DDP處理后升高明顯，且聯(lián)合組的表達(dá)量明顯大于兩個(gè)單藥組。索拉非尼單藥或聯(lián)合DDP處理48 h后CAL－51細(xì)胞的p－JNK表達(dá)亦明顯升高，但索拉非尼單藥和聯(lián)合DDP處理后p－JNK的表達(dá)沒有明顯不同 (見圖1)。

表3 不同劑量DDP聯(lián)合索拉非尼對(duì)各細(xì)胞株生長抑制率比較，%)Table 3 Inhibitory effects of DDPcombined with Sorafenib of different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines

表3 不同劑量DDP聯(lián)合索拉非尼對(duì)各細(xì)胞株生長抑制率比較，%)Table 3 Inhibitory effects of DDPcombined with Sorafenib of different concentrations on proliferation of breast cancer cell lines

濃度(M)例數(shù) MDA－MB－231 MDA－MB－468 CAL－51 F值 P值4+2 3 13.3±1.8 63.3±1.1 63.3±2.3 789.075 0.000 8+4 3 35.0±0.5 73.5±1.9 77.4±0.9 973.047 0.000 10+5 3 47.2±1.6 79.0±1.5 84.7±0.9 643.047 0.000 12+6 3 57.2±1.6 81.1±0.4 87.4±1.8 368.377 0.000 14+7 3 61.3±1.9 87.8±3.2 93.3±1.1 178.638 0.000 F 458.280 73.351 172.469 P值值0.000 0.000 0.000

表4 不同劑量的DDP和索拉非尼對(duì)不同乳腺癌細(xì)胞株的CITable 4 Combination index(CI)of different concentrations of DDP andSorafenib on four kinds of breast cancer cell lines

圖1 索拉非尼或 (和)DDP作用MDA－MB－231，MDA－MB－468和CAL－51細(xì)胞48 h后，對(duì)MAPK信號(hào)通路蛋白的影響Figure 1 Effect on MAPK signaling pathway proteins 48 h after application of Sorafenib or/and cisplatin on MDA－MB－231，MDA－MB－468 and CAL－51 cells

3 討論

TNBC是乳腺癌中最富有挑戰(zhàn)性的，目前最主要的治療措施仍為全身化療，但其預(yù)后依然很差。索拉非尼是一種口服的多激酶抑制劑，能抑制RAF、c－KIT、VEGFR－2、VEGFR－3、PDGFR－、FLT3等激酶的活性［6］。在多種腫瘤包括肝癌［7］、甲狀腺癌［8］、胃腸間質(zhì)瘤［9］的臨床研究中均顯示出確切的抗腫瘤增殖的活性。DDP是一種類烷化劑的金屬鉑類化合物，BRCA1相關(guān)性乳腺癌對(duì)鉑類藥物相當(dāng)敏感。本研究首次進(jìn)行了索拉非尼單藥或 (和)聯(lián)合DDP體外治療TNBC的研究。MTT結(jié)果表明DDP與索拉非尼單藥對(duì)3種TNBC細(xì)胞株的體外生長均有抑制作用，且抑制率隨著藥物劑量增加而增加，具有劑量效應(yīng)依賴關(guān)系。這表明兩藥聯(lián)用達(dá)到對(duì)乳腺癌細(xì)胞同樣的抑制作用時(shí)所需藥物劑量較其單獨(dú)應(yīng)用時(shí)極大降低，這對(duì)于臨床用藥時(shí)降低藥物劑量，減少毒副作用具有重要的意義。因此，本研究MTT結(jié)果支持了生物化療這一腫瘤治療新模式的先進(jìn)性，聯(lián)合用藥取得了更好的腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用。與單藥相比，聯(lián)合用藥進(jìn)一步提高了療效，而且減少各單藥的用藥劑量，因而可能減少藥物的毒副作用，提高耐受性。

經(jīng)10多年對(duì)DDP與MAPK信號(hào)途徑的研究認(rèn)為，MAPK是細(xì)胞對(duì)DDP反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因素。JNK活化可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，減輕DDP的耐藥性［10－11］。本研究中僅發(fā)現(xiàn)MDA－MB－231細(xì)胞DDP單藥組p－JNK表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，而ERK、p－ERK和JNK的表達(dá)較對(duì)照組無明顯變化;3種細(xì)胞經(jīng)DDP單藥處理48 h后ERK、p－ERK、JNK和p－JNK的表達(dá)較對(duì)照組均無明顯變化。DDP單藥對(duì)MDAMB－468和CAL－51細(xì)胞的抑制作用可能不是通過影響ERK和JNK通路起作用。在聯(lián)合用藥中發(fā)現(xiàn)，DDP能協(xié)同增強(qiáng)索拉非尼對(duì)JNK的磷酸化，這說明DDP能協(xié)同增強(qiáng)索拉非尼對(duì)JNK通路的激活，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡。MDA－MB－468細(xì)胞的聯(lián)合用藥組p－ERK明顯低于索拉非尼單藥組，說明DDP能協(xié)同抑制ERK的磷酸化，抑制ERK通路的活性，從而抑制細(xì)胞的增殖。但是在其他細(xì)胞的聯(lián)合組中沒有觀察到DDP聯(lián)合索拉非尼對(duì)ERK通路有協(xié)同抑制作用。

Liu等［7］研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼通過抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2的RAF/ERK通路，使MEK和ERK的磷酸化水平下降，下調(diào)CyclinDl，使增殖期細(xì)胞不能通過“G1－S”調(diào)節(jié)點(diǎn)，影響細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡。Wei等［12］研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼聯(lián)合維生素K能在體外通過抑制p－ERK和Bcl－2的表達(dá)，增加p－JNK、c－Jun和FALS的表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼單藥和聯(lián)合DDP處理各細(xì)胞株，均能見到p－ERK的表達(dá)較空白對(duì)照組和DDP單藥組明顯降低，p－JNK的表達(dá)明顯升高。只在MDA－MB－468細(xì)胞的聯(lián)合用藥組發(fā)現(xiàn)，p－ERK的表達(dá)明顯低于索拉非尼單藥組。原因可能是索拉非尼單藥對(duì)ERK通路的抑制能力太強(qiáng)，使p－ERK明顯減低，而使DDP協(xié)同索拉非尼抑制ERK的表達(dá)作用無法顯現(xiàn)，可能降低索拉非尼的劑量能更好觀察二者的協(xié)同作用。因此，ERK通路抑制及JNK通路的激活是兩藥聯(lián)合增效的部分機(jī)制。

本研究的意義在于首次發(fā)現(xiàn)DDP聯(lián)合索拉非尼在體外能協(xié)同抑制多種TNBC細(xì)胞株的增殖，并初步闡明分子機(jī)制，為該方案的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 Kang SP，Martel M，Harris LN.Triple negative breast cancer:current understanding of biology and treatment options［J］.Curr Opin Obstet Gynecol，2008，20(1):40 －46.

2 Reis－Filho JS，Tutt AN.Triple negative tumours:a critical review［J］.Histopathology，2008，52(1):108－18.

3 Banerjee S，Reis－Filho JS，Ashley S，et al.Basal－like breast carcinomas:clinical outcome and response to chemotherapy［J］.J Clin Pathol，2006，59(7):729 －735.

4 Bauer KR，Brown M，Cress RD，et al.Descriptive analysis of estrogen receptor(ER) －negative，progesterone receptor(PR) －negative，and HER2－negative invasive breast cancer，the so－called triple－negative phenotype:a population－based study from the California cancer Registry［J］.Cancer，2007，109(9):1721 －1728.

5 Chou TC，Talalay P.Quantitative analysis of dose－effect relationships:the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors［J］.Adv Enzyme Regul，1984，22:27 －55.

6 Wilhelm SM，Carter C，Tang L，et al.BAY 43－9006 exhibits broad spectrum oral antitumor activity and targets the RAF/MEK/ERK pathway and receptor tyrosine kinases involved in tumor progression and angiogenesis［J］.Cancer Res，2004，64(19):7099 －7109.

7 Liu L，Cao Y，Chen C，et al.Sorafenib blocks the RAF/MEK/ERK pathway，inhibits tumor angiogenesis，and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5 ［J］. Cancer Res，2006，66(24):11851－11858.

8 Alfano RW，Leppla SH，Liu S，et al.Inhibition of tumor angiogenesis by the matrix metalloproteinase－activated anthrax lethal toxin in an orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma ［J］.Mol Cancer Ther，2010，9(1):190－201.

9 Yang F，Brown C，Buettner R，et al.Sorafenib induces growth arrest and apoptosis of human glioblastoma cells through the dephosphorylation of signal transducers and activators of transcription 3 ［J］.Mol Cancer Ther，2010，9(4):953－962.

10 Hong HY，Kim BC.Mixed lineage kinase 3 connects reactive oxygen species to c－Jun NH2－terminal kinase－induced mitochondrial apoptosis in genipin－treated PC3 human prostate cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，362(2):307－312.

11 Park EJ，Zhao YZ，Kim YC，et al.Bakuchiol－induced caspase－3－dependent apoptosis occurs through c－Jun NH2－terminal kinasemediated mitochondrial translocation of Bax in rat liver myofibroblasts［J］.Eur J Pharmacol，2007，559(2/3):115 －123.

12 Wei G，Wang M，Carr BI.Sorafenib combined vitamin K induces apoptosis in human pancreatic cancer cell lines through RAF/MEK/ERK and c－ Jun NH2 － terminal kinase pathways［J］.J Cell Physiol，2010，224(1):112－119.