李霞緋，李 強(qiáng)，陳紫君，劉 純

熱休克蛋白 (heat shock protion，HSP)是一類具有重要生理功能和高度保守的多肽類蛋白質(zhì)分子家族，普遍存在于原核和真核細(xì)胞中，從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物體內(nèi)均可見(jiàn)其表達(dá)［1］。人們發(fā)現(xiàn)缺血、缺氧、重金屬、病毒感染、惡變等刺激均可引發(fā)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，從而合成HSP，故又稱為應(yīng)激蛋白［2］。已有研究發(fā)現(xiàn)，Graves病 (Graves disease，GD)患者甲狀腺［3］以及Graves眼病 (Graves ophthalmopathy，GO)患者球后成纖維細(xì)胞上［4］都有HSP70的過(guò)量表達(dá)，且參與了疾病的自身免疫過(guò)程。越來(lái)越多的研究顯示，細(xì)胞內(nèi)HSP70可以進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展，在某些疾病患者的循環(huán)血液中也檢測(cè)到高于正常人水平的HSP70，如心肌梗死［5］、動(dòng)脈粥樣硬化［6］等，并且血液中細(xì)胞外HSP70水平與疾病的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。細(xì)胞外HSP70能通過(guò)古老的TOLL樣受體 (toll like receptors，TLRs)信號(hào)途徑激活巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞，HSP70和TLRs結(jié)合后，所激活的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和白介素1受體 (interleukin－1 receptor，IL－1R)基本相同，均通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)MyD88→IRAK→TRAF6/ECSIT→NIK/IKK，引起核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor－κB，NF－κB)的活化，最終引起巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子［7］。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)GD患者血漿中HSP70及炎性因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF－α)的水平變化以及GD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)通路的起始點(diǎn)TLR及終末點(diǎn)NF－κB的基因表達(dá)，來(lái)探討細(xì)胞外HSP70在GD發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年3—7月我院內(nèi)分泌門診確診的GD初發(fā)患者25例 (病例組)，其中男8例，女17例;平均年齡 (33.9±6.7)歲;同時(shí)收集本院25例健康體檢者 (對(duì)照組)，其中男8例，女17例;平均年齡 (34.4±6.3)歲。病例組符合第7版《內(nèi)科學(xué)》GD診斷標(biāo)準(zhǔn):有典型甲狀腺功能亢進(jìn)癥狀、體征，伴有游離三碘甲狀腺原氨酸 (FT3)、游離甲狀腺素 (FT4)水平升高，促甲狀腺素 (sTSH)水平降低及甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體 (TPO－Ab)和 (或)甲狀腺球蛋白抗體 (Tg－Ab)、促甲狀腺素受體抗體 (TRAb)升高，均未接受過(guò)抗甲狀腺藥物治療。研究對(duì)象均排除近期感染史、妊娠、精神創(chuàng)傷、劇烈運(yùn)動(dòng)以及合并心血管慢性疾病、腫瘤、類風(fēng)濕等與自身免疫有關(guān)的疾病。血液標(biāo)本采自禁食12 h以上的靜脈血，并及時(shí)離心分離血清，放置－20℃保存。

1.2 方法 血清HSP70、TNF－α和TRAb采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)法測(cè)定，外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4及NF－κB的mRNA表達(dá)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT－PCR)測(cè)定，試劑盒分別由武漢中美科技和R＆D提供。丙二醛 (MDA)采用比色法測(cè)定，試劑盒由南京生物建成提供。FT3、FT4、sTSH、TPO－Ab、Tg－Ab采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定，由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn);相關(guān)分析采用等級(jí)相關(guān)法 (Pearson法)。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 病例組患者血漿HSP70、TNF－α、MDA水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05，見(jiàn)表1)。

表1 病例組與對(duì)照組受檢者血漿HSP70、TNF－α、MDA水平比較Table 1 Comparison of levels of HSP70，TNF－α，MDA in GD and normal controls

表1 病例組與對(duì)照組受檢者血漿HSP70、TNF－α、MDA水平比較Table 1 Comparison of levels of HSP70，TNF－α，MDA in GD and normal controls

注:HSP70=熱休克蛋白70，TNF－α=腫瘤壞死因子α，MDA=丙二醛

組別 例數(shù) HSP70(ng/L)TNF－α(ng/L)MDA(μmol/L)病例組25 168±101 27.5±12.1 7.22±0.91對(duì)照組 25 42± 18 7.1± 2.6 4.04±0.57 t 值6.144 4.62 12.809 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05

2.2 相關(guān)分析顯示，病例組GD患者血漿HSP70水平與TNF－α、MDA、FT3、FT4呈正相關(guān)，與 sTSH呈負(fù)相關(guān) (p＜0.05);血漿HSP70水平與TPO－Ab、Tg－Ab、TRAb無(wú)相關(guān)性 (P＞0.05，見(jiàn)表2)。

表2 病例組GD初發(fā)患者血漿HSP70水平與各因素的相關(guān)性Table 2 Relationship between HSP70 with TNF－α，MDA，hyroid function and autoimmune antibodies in GD patients

2.3 病例組患者外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)量 (0.185±0.006)顯著高于對(duì)照組 (0.081±0.039)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=13，p＜0.01);NF－κB mRNA表達(dá)量 (0.73±0.049)亦顯著高于對(duì)照組 (0.31±0.039)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=31，p＜0.01)。

3 討論

GD患者甲狀腺［3］以及GO患者球后成纖維細(xì)胞上［4］都有HSP70的過(guò)量表達(dá)，且提示細(xì)胞內(nèi)HSP70參與了疾病的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，GD患者血漿中HSP70水平顯著高于健康者，提示GD患者細(xì)胞外HSP70水平上升;同時(shí)，與健康者比較，GD患者血漿氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA及炎性細(xì)胞因子TNF－α水平也有顯著升高，而且GD患者血漿HSP70水平與TNF－α、MDA水平呈正相關(guān)。其實(shí)活性氧族和炎性細(xì)胞因子均可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)HSP70的過(guò)量表達(dá)［8］。而且炎性細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)HSP70的細(xì)胞外釋放［9］。另外，氧化應(yīng)激也被認(rèn)為參與了鍛煉誘導(dǎo)的循環(huán)HSP70升高，并且用維生素C和維生素E能抑制其升高［10］。應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞外HSP70能作為一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號(hào)分子，提示細(xì)胞應(yīng)激或損傷，從而引出先天免疫和獲得性炎癥免疫反應(yīng)［11］。HSP70激活細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)通路主要是通過(guò)與細(xì)胞表面TLR結(jié)合，激活的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和IL－1R基本相同，均通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)MyD88→IRAK→TRAF6/ECSIT→NIK/IKK，引起NF－κB的活化，最終引起巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子并最終激活NF－κB來(lái)完成的［7］。有研究者用“危險(xiǎn)理論”［12］來(lái)解釋其功能:應(yīng)激所產(chǎn)生的細(xì)胞外HSP70可能作為一種“危險(xiǎn)信號(hào)”促進(jìn)機(jī)體的免疫功能，從而幫助清除病原體。在急性炎癥時(shí)，細(xì)胞外HSP70通過(guò)TLR2和 (或)TLR4激活免疫細(xì)胞，產(chǎn)生一氧化氮和其他炎性因子，促使病原物的清除和炎癥的減退。而在慢性炎癥性疾病時(shí)，應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞外HSP70使炎性因子水平持續(xù)過(guò)度升高，反而導(dǎo)致病情惡化。GD的發(fā)病機(jī)制已公認(rèn)主要與免疫因素有關(guān)，其病理?yè)p傷實(shí)際上是一種免疫炎性反應(yīng)過(guò)程［13］。本研究發(fā)現(xiàn)血漿中HSP70和TNF－α水平均顯著高于健康者，并且血漿HSP70水平與TNF－α及甲狀腺功能相關(guān)。而且GD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞上炎癥反應(yīng)鏈的起始點(diǎn)TLR4和終末環(huán)節(jié)NF－κB的mRNA表達(dá)均較健康者顯著增加。提示內(nèi)源性細(xì)胞外HSP70可能通過(guò)TLR4激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，引起NF－κB的活化，最終引起巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子，從而激活和加劇GD的炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞外HSP70除了刺激炎性因子的產(chǎn)生，還能促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞 (antigen－presenting cell，APC)的成熟和遷移，以及APC和T淋巴細(xì)胞的相互作用，從而引發(fā)獲得性免疫反應(yīng)［14］。細(xì)胞外HSP70能在抗原加工過(guò)程中與抗原肽結(jié)合，形成的HSP－肽復(fù)合物經(jīng)壞死或?yàn)l死細(xì)胞釋放后與APC上的受體結(jié)合，抗原通過(guò)HSP被遞送給主要組織相容性復(fù)合體－I［15］，同樣說(shuō)明HSP能夠刺激獲得性免疫反應(yīng)。GD是一種自身免疫性疾病，體液免疫和細(xì)胞免疫均參與了GD的發(fā)病。本研究還發(fā)現(xiàn)GD患者血漿中升高的HSP70與TPO－Ab、Tg－Ab、TRAb不相關(guān)，提示GD患者體內(nèi)自身免疫反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，其變化可能與個(gè)體自身的免疫過(guò)程有關(guān)，同時(shí)提示細(xì)胞因子間有著非常復(fù)雜的相互作用關(guān)系，細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)失調(diào)可能造成了GD的發(fā)生發(fā)展。

總之，升高的血漿HSP70水平反映了GD的系統(tǒng)炎癥和疾病的嚴(yán)重程度，但需要更進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)血漿HSP70在GD中的免疫調(diào)節(jié)作用。

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