王 舟，宗俊勤，郭海林，劉建秀

(1.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇 南京210014；2.廣西梧州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，廣西 梧州543001)

結(jié)縷草(Zoysiajaponica)是暖季型草坪草中最抗寒的草種，具有良好的耐旱、耐鹽堿、耐踐踏、耐瘠薄、抗病蟲害等特性[1-2]，這決定了它擁有眾多的優(yōu)良性狀和豐富的遺傳多樣性，是很好的研究植物抗性機制的草坪草。而如何有效發(fā)掘利用這些有利基因一直是研究的熱點，但結(jié)縷草遺傳背景復(fù)雜，通過常規(guī)的基因克隆方法獲取有利基因存在許多問題，效率極低。cDNA文庫的構(gòu)建是研究不同發(fā)育階段和特定時期的基因表達(dá)、分離組織特異性基因以及克隆新型細(xì)胞因子的有利工具[3-4]。由于cDNA文庫是生物體在特定發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA片段與載體連接形成的克隆的集合，故不含有內(nèi)含子[5-6]。源于這些cDNA片段的短的、單向測定的序列片段即為表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag，EST)，是一種發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因表達(dá)譜的有效工具[7-8]。通過大規(guī)模的EST測序分析，可以獲得基因組中編碼序列區(qū)的核苷酸全序列圖，并可通過已知功能基因的相似性分析推測每條EST所代表基因的功能。自20世紀(jì)70年代中期首例cDNA克隆問世以來，cDNA文庫已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建遺傳學(xué)圖譜、分離與鑒定新基因、基因差異表達(dá)和比較基因組學(xué)、功能基因組學(xué)等研究[9]。目前擬南芥(Arabidopsisthaliana)[10-11]、水稻(Oryzasativa)[12]、小麥(Triticumaestivum)[13]、玉米(Zeamays)[14]和棉花(Gossypiumhirsutum)[15-16]等重要植物的全長cDNA文庫已成功構(gòu)建并用于后期蛋白質(zhì)表達(dá)及功能分析[17-18]。近年來，EST和cDNA文庫篩選已成為一種高效率、低成本的發(fā)現(xiàn)未知新基因的快捷技術(shù)[9,19-20]。特別是對非模式物種，通過cDNA文庫篩選目的基因更具明顯優(yōu)勢[21]。

相對于擬南芥、水稻、小麥等植物，結(jié)縷草的分子生物學(xué)研究還屬起步階段，多集中于采用分子標(biāo)記手段進(jìn)行遺傳分析及親緣關(guān)系的鑒定[22-25]，而對功能基因的分離研究鮮有報道。截至目前，GenBank中登錄的來源于結(jié)縷草的核苷酸序列僅有197條，遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他園藝觀賞植物，而dbEST中甚至沒有結(jié)縷草EST的登錄信息記錄。在這197條序列中絕大部分為葉綠體相關(guān)基因，其次為線粒體相關(guān)基因、NADH脫氫酶基因等，而對這些基因的研究多是用作分子標(biāo)記為鑒定結(jié)縷草品種親緣關(guān)系服務(wù)的。結(jié)縷草基因的分離主要是通過蛋白質(zhì)純化、N端氨基酸序列分析以及RACE等方法獲得，而有關(guān)結(jié)縷草cDNA文庫方面的研究國內(nèi)外尚未見報道。

為進(jìn)一步獲取結(jié)縷草抗逆信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因信息，從分子水平深入挖掘和利用結(jié)縷草潛在的基因資源，完善其基因組信息，本研究以坪用價值高的優(yōu)良結(jié)縷草品種Meyer為建庫材料，經(jīng)低溫和干旱誘導(dǎo)處理，采用先進(jìn)的Gateway技術(shù)首次成功地構(gòu)建了包含結(jié)縷草抗寒、抗旱特異性表達(dá)基因的高質(zhì)量cDNA文庫，旨在為今后大規(guī)模EST測序、基因表達(dá)譜分析、分離克隆具有育種價值的抗逆相關(guān)基因，研究其功能及代謝途徑和網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐，為開展分子育種工作開辟一條新的途徑。這對改善我國草坪業(yè)的自主知識產(chǎn)權(quán)現(xiàn)狀具有重要意義。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料 供試結(jié)縷草品種為美國引進(jìn)的優(yōu)良品種Meyer(Z.japonicacv.Meyer)。對在自然條件下萌發(fā)生長6周的健壯植株分別進(jìn)行低溫和干旱處理。1)低溫處理：將材料置于4 ℃下冷處理5～6 h；2)干旱處理：將材料置于25 ℃人工培養(yǎng)箱中，停止?jié)菜?～5 d，直至土壤出現(xiàn)龜裂。收集上述處理材料的葉片用液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2文庫載體 pCMV·SPORT6，具有Gateway兼容性(Gateway Compatibility)，在其多克隆位點(Multiple Cloning Site，MCS)的雙側(cè)翼含有GatewayattB1和attB2重組位點。

1.1.3主要試劑 cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(SuperScriptTMPlasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning)、RNA提取試劑(TRIzol Reagent)、mRNA分離試劑盒(FastTrack 2.0 Kit)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SuperScriptTMII First-Strand Synthesis System for RT-PCR)、DNA分子量標(biāo)記(1 kb Plus DNA Ladder)、超純瓊脂糖(UltraPureTMAgarose)、熱啟動型DNA聚合酶(Platinum Taq DNA Polymerase)、dNTP混合液(100 mmol·L-1dNTP Set)、超純酚∶氯仿∶異戊醇[UltraPureTMPhenol∶Chloroform∶Isoamyl Alcohol (25∶24∶1，體積比)]均購自Invitrogen公司，分子生物學(xué)用醋酸銨[Ammonium acetate solution for molecular biology (7.5 mol·L-1)]購自Sigma公司。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA的提取 分別取-80 ℃下保存的低溫、干旱誘導(dǎo)后的兩種樣品各100 mg混合，于加有液氮的研缽中迅速研磨后，轉(zhuǎn)移至RNase-free的1.5 mL離心管中，立即加入1 mL TRIzol提取液，混勻后，后續(xù)的操作參照TRIzol說明書進(jìn)行總RNA的提取。沉淀用75%乙醇洗滌，DEPC處理水溶解，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性和穩(wěn)定性，并用紫外分光光度計測定RNA的純度及含量。

1.2.2mRNA的分離 取大于500 μg的總RNA，參照試劑盒FastTrack 2.0 Kit操作說明書分離和純化mRNA。

1.2.3雙鏈cDNA的合成 取5 μg的mRNA，按照試劑盒SuperScriptTMPlasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning使用說明進(jìn)行操作，SuperScriptTMII RT酶合成cDNA第1鏈。隨后，參照試劑盒操作程序合成cDNA第2鏈。

1.2.4柱層析分級分離及收集 取25 μL cDNA與10 μLSalI接頭(50 ng·μL-1)，T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NotI于37 ℃酶切3 h，產(chǎn)生粘性末端。酶切產(chǎn)物過cDNA Size Fractionation Columns柱(試劑盒提供)，并按試劑盒使用說明收集前150 ng的cDNA產(chǎn)物。

1.2.5連接載體 依試劑盒要求取10 μL cDNA與1 μLNotI-SalI-Cut pCMV·SPORT6載體，在T4 DNA連接酶作用下室溫反應(yīng)3～5 h或4 ℃連接過夜。

1.2.6電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B 參照試劑盒說明書，在冰上將2 μL連接產(chǎn)物和50 μL電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞DH10B加入電轉(zhuǎn)杯。TX ECM 630電轉(zhuǎn)化儀上電擊條件設(shè)置為：電壓2.0 kV，電阻200 Ω，電容25 μF。電擊后迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入冰上預(yù)冷的SOC培養(yǎng)基1 mL。將電轉(zhuǎn)物全量轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，37 ℃ 225～250 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h，獲得原始文庫。

1.2.7文庫質(zhì)量評價

1)滴度和庫容量鑒定：取電轉(zhuǎn)化后的原始文庫原液10 μL稀釋1 000倍后，從中取出50 μL涂布于IPTG/X-Gal的LB平板(含100 μg·mL-1氨芐青霉素)上，37 ℃培養(yǎng)過夜，次日統(tǒng)計菌落數(shù)。

2)插入片段大小及重組率鑒定：從原始文庫中隨機挑取50個單克隆，以M13F-M13R為引物，PCR檢測插入片段大小并估計文庫重組率。95 ℃變性5 min裂解菌體后，加入PCR反應(yīng)混合物，擴增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析插入片段的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1總RNA的提取 RNA的完整度與穩(wěn)定性決定了cDNA的質(zhì)量，是構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫的關(guān)鍵。提取經(jīng)低溫、干旱誘導(dǎo)后的結(jié)縷草葉片總RNA，取2 μL RNA溶液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果可見兩條清晰的28S和18S rRNA條帶(圖1)，表明提取的總RNA具有良好的完整度及穩(wěn)定性。紫外分光光度計檢測RNA溶液的OD值，測得OD260 nm/OD280 nm=1.90，說明RNA純度較好，可以用來分離mRNA，為建立高質(zhì)量結(jié)縷草cDNA文庫奠定了基礎(chǔ)。

圖1 提取的結(jié)縷草總RNA

2.2mRNA的分離與純化 采用FastTrack 2.0 Kit試劑盒從總RNA中分離和純化mRNA。電泳檢測顯示，mRNA呈均勻彌散狀(圖2)，主要分布在1 000 bp以上，質(zhì)量良好，符合建庫的要求。

圖2 分離和純化后的mRNA

2.3反轉(zhuǎn)錄與雙鏈cDNA的合成 用約5 μg mRNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA(ds cDNA)，取5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結(jié)果可見，ds cDNA呈彌散狀條帶，主要分布于1 000 bp以上(圖3)，說明不同大小和不同豐度的mRNA都得到了有效的反轉(zhuǎn)錄和擴增，滿足建庫的需要。

圖3 反轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈cDNA

2.4文庫質(zhì)量評價

2.4.1cDNA原始文庫的滴度和庫容量鑒定 原始文庫滴度可估計cDNA文庫的克隆數(shù)，同時還代表了mRNA的復(fù)雜度。將過柱收集的cDNA片段與質(zhì)粒載體pCMV·SPORT6連接后，轉(zhuǎn)化到受體菌DH10B。按照SuperScriptTMPlasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning試劑盒提供的方法進(jìn)行文庫滴度和庫容量的測定。

一個高質(zhì)量的文庫，其滴度應(yīng)大于1×106pfu·mL-1，庫容量應(yīng)大于5×106pfu[26]，能保證低豐度基因的出現(xiàn)頻率達(dá)到99%[27]。原始文庫稀釋1 000倍后，取50 μL涂布，獲得克隆數(shù)88個，經(jīng)計算得到文庫的滴度為1.76×106pfu·mL-1，庫容量為7.04×106pfu。由此可見，本研究構(gòu)建的結(jié)縷草低溫和干旱誘導(dǎo)cDNA文庫是一個較高質(zhì)量的文庫，足以克隆到低豐度表達(dá)的基因。

2.4.2插入片段大小和重組率鑒定 插入片段大小和重組率是評價cDNA文庫質(zhì)量的另外兩個重要指標(biāo)。從原始文庫中隨機挑取的單克隆PCR檢測結(jié)果表明，文庫重組率達(dá)到90%。插入片段最大可達(dá)2.5 kb，主要集中在大于1 kb的區(qū)域(圖4)。植物cDNA一般為0.5～3.0 kb，大多大于或等于1 kb[28]。本研究構(gòu)建的文庫符合構(gòu)建高質(zhì)量文庫的標(biāo)準(zhǔn)，文庫中長片段所占比例較大，表明插入片段序列的完整性較好，適合以后的測序及后續(xù)篩選基因與基因功能的研究。

圖4 cDNA文庫插入片段大小的PCR檢測

3 討論

植物基因組的研究已經(jīng)由以全基因組測序為目標(biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)，通過cDNA文庫篩選分離全長基因和開展基因功能研究已成為功能基因組學(xué)研究的基本手段之一。cDNA文庫代表了mRNA的反轉(zhuǎn)錄復(fù)本[29-31]，高質(zhì)量cDNA文庫的構(gòu)建是大規(guī)模EST測序的必要保證，也是有效研究基因表達(dá)的基礎(chǔ)。cDNA文庫的質(zhì)量主要反映在兩個方面：一是文庫的代表性，即文庫中含有的cDNA種類的完整性。只有足夠的克隆數(shù)才能保證擁有一定數(shù)量的低豐度表達(dá)的mRNA，反映來源細(xì)胞中所表達(dá)的全部遺傳信息。其可用滴度和庫容量的大小來定量衡量，滴度越大表明獲得目的基因的可能性越大。二是插入cDNA片段的序列完整性。只有大部分克隆含有接近全長的cDNA插入，文庫才能體現(xiàn)天然的、完整的遺傳信息，即插入片段的大小越大，表明分離到基因全長的可能性越大。本研究對結(jié)縷草供試材料進(jìn)行了低溫和干旱的誘導(dǎo)處理，可以大幅度提高目的誘導(dǎo)基因的表達(dá)豐度，理論上即使是低豐度的基因也可以獲得篩選。此外，從PCR鑒定文庫質(zhì)量的結(jié)果來看，cDNA片段插入重組率高達(dá)90%，這也為今后基因分離的效率提供了有力保證。

文庫的滴度、重組率和插入片段的大小是鑒定cDNA文庫質(zhì)量的重要指標(biāo)[4,32]。滴度的高低是能否通過篩選cDNA文庫獲得目的基因的衡量依據(jù)，高庫容量是文庫測序獲得非重復(fù)EST的保證[32]。一般而言，在典型的真核生物中每時每刻表達(dá)的mRNA約占生物所有基因的15%，約1.5萬種，其中低豐度mRNA種類約占30%[33]。為使文庫中出現(xiàn)某種低豐度的mRNA這一事件的發(fā)生達(dá)到給定的概率，則文庫所需的獨立克隆數(shù)，可以通過Clack-Carbon公式N=ln(1-P)/ln(1-f)(N為實際所需克隆數(shù)，P為要求的概率，f為1/n，n為某一類型的稀有mRNA在總mRNA中所占的相對比例)計算。當(dāng)要求篩選到某低豐度mRNA的概率為99%時，由上述公式計算出的文庫所需克隆數(shù)應(yīng)不低于1.7×105pfu·mL-1，此即為有效的文庫[32]。但為滿足篩選到低豐度mRNA的要求，一般cDNA文庫構(gòu)建要求其滴度不少于1×106pfu·mL-1[34]。構(gòu)建文庫過程中，片段分級分離與載體連接時，cDNA片段大小與cDNA濃度對建庫的影響至關(guān)重要，如不能有效去除小片段cDNA，則其會優(yōu)先與載體連接，導(dǎo)致文庫平均插入片段過小，嚴(yán)重影響文庫質(zhì)量，但過度篩除cDNA片段，則會造成文庫的初始滴度下降，從而丟失一些基因信息。分級分離的標(biāo)準(zhǔn)一般是回收500 bp以上的cDNA片段[35]。針對構(gòu)建文庫篩選功能基因全長的目的，本研究在保證插入片段較大的同時，兼顧了文庫的滴度。經(jīng)檢測，本研究所構(gòu)建的cDNA原始文庫滴度為1.76×106pfu·mL-1，保證了文庫的完整性與覆蓋度，理論上包含了脅迫誘導(dǎo)后結(jié)縷草葉片中表達(dá)的所有基因[32,36-37]；插入片段的平均大小超過1 kb，重組率為90%，表明序列的完整性很高，能夠包含絕大多數(shù)基因表達(dá)的cDNA信息，保證了在通過篩選cDNA文庫獲取目的基因時稀有基因不會被遺漏[32,36-37]。由此可見，所構(gòu)建的文庫達(dá)到了完整、有效并且高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，滿足分離低豐度表達(dá)基因序列的要求，可用于后續(xù)篩選其中特異表達(dá)的低豐度基因、組織特異性基因表達(dá)譜分析、基因組序列的功能注釋以及功能基因在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上調(diào)控的分子機制等許多領(lǐng)域的研究。通過EST測序、分子雜交、扣除法等技術(shù)探明結(jié)縷草生長、發(fā)育、次生代謝和生化合成途徑及對環(huán)境脅迫反應(yīng)的分子機理[38-40]，不僅為后期在分子水平上調(diào)控結(jié)縷草的生長、發(fā)育和抗逆性奠定了實驗基礎(chǔ)，還提供了技術(shù)平臺和良好的前提材料。

本研究是利用Gateway技術(shù)構(gòu)建的高質(zhì)量全長cDNA文庫，因此文庫所分離的cDNA克隆包含了相對應(yīng)的mRNA分子完整的序列。此文庫所用的克隆載體pCMV·SPORT6，具有Gateway兼容性，在其多克隆位點的雙側(cè)翼含有Gateway位點特異性的重組位點(attB1和attB2)，cDNA克隆位點即位于多克隆位點內(nèi)。因此，通過位點特異性重組就可將從文庫分離到的克隆快速轉(zhuǎn)化至其他Gateway載體，而無需經(jīng)過限制性內(nèi)切酶的酶解和連接酶的連接。Gateway克隆可以方便地用于DNA測序、RNA探針制備或者表達(dá)重組蛋白。此外，在文庫構(gòu)建的過程中第2鏈合成采用的是置換合成法，而沒有采用PCR擴增，能夠保持材料中的mRNA原始豐度，而不會由于PCR擴增效率的不同，使得原始豐度在文庫中反映失真，這使一些較低拷貝數(shù)基因的克隆具有優(yōu)勢。同時，作為優(yōu)化的文庫系統(tǒng)及后期大規(guī)模測序結(jié)果可以應(yīng)用于進(jìn)一步的芯片制作。

cDNA文庫篩選和RACE技術(shù)是兩種獲得全長cDNA最重要的方法，其中cDNA文庫篩選還具有高通量的特點，適合于大規(guī)模獲得全長cDNA。在此基礎(chǔ)上分析不同基因在逆境脅迫過程中的表達(dá)，從中篩選出特異性表達(dá)的基因，進(jìn)一步分析其功能，并最終研究抗逆相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為育種工作奠定理論基礎(chǔ)。與農(nóng)作物(如水稻、小麥等)相比，國內(nèi)外對草坪草和牧草的開發(fā)利用，特別是分子生物學(xué)相關(guān)研究，還處于起步階段。本研究構(gòu)建了低溫和干旱誘導(dǎo)的結(jié)縷草葉片cDNA文庫，文庫中功能基因的數(shù)量、基因表達(dá)的豐度與結(jié)縷草自身抗寒、抗旱等抗逆性密切相關(guān)。目前在公共數(shù)據(jù)庫中，報道結(jié)縷草cDNA文庫尚屬首次。此高質(zhì)量文庫的成功構(gòu)建是鑒定和克隆相關(guān)重要功能基因及開展分子育種的重要平臺，有助于深入了解結(jié)縷草遺傳背景，揭示其抗逆性的分子機理，為進(jìn)一步獲得擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗逆新品種提供了有力的保障，具有重要的應(yīng)用價值。

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