顏延鳳，許 立，陳 超，許尤琪

(1.南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210014；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210017)

胃癌(gastric cancer)是臨床常見惡性腫瘤之一，而我國是胃癌的高發(fā)地區(qū)，有報道[1]我國胃癌年患病率和病死率均是世界平均水平的2倍。本實驗試從腫瘤轉(zhuǎn)移的角度出發(fā),通過體外實驗，觀察南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院抗胃癌經(jīng)方胃安寧顆粒含藥血清對人胃癌MGC-803細(xì)胞COX-2 mRNA、VEGF mRNA表達(dá)的影響，從而為其進(jìn)一步研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物及細(xì)胞株 SD大鼠40只，清潔級，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，浙江，實驗動物合格證號SCXK(浙)2008-0033。實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2007-0030。MGC-803細(xì)胞株由南京凱基生物有限公司提供。

1.2 藥品和試劑 胃安寧顆粒，由南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室制，批號：20090513；PBS，福州邁新恒武技術(shù)開發(fā)有限公司，批號：11030202Y；1640培養(yǎng)液，Thermo，批號：NWE04009；胰酶，Gibco，批號2011/04；胎牛血清，杭州四季青，批號：110311；雙抗，Gibco,批號：15140；Trizol，Invitrogen公司；1382739；COX-2 mRNA、VEGF mRNA引物合成，上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 JA-1203電子天平：上海天平儀器；CO2培養(yǎng)箱：日本SANYO；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；中科美菱超低溫冰箱，中科美菱低溫科技有限公司；ELS-10T生命科學(xué)型超純水機,南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；80-2型臺式離心機，上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠；倒置顯微鏡，Olympus，CHK-213；Western 電泳儀，Bio-Rad，America，164-5051；多用脫色搖床，江蘇金壇市正基儀器廠，HY-4；高速冷凍離心機，美國科俊儀器公司，SH03014；GDS8000凝膠掃描系統(tǒng)，Syngene Corporation，England。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代培養(yǎng) 將凍存的人胃癌細(xì)胞(MGC-803)傳代細(xì)胞株取出，快速置于40 ℃水浴解凍，并轉(zhuǎn)移細(xì)胞液于離心管中，加入適量培養(yǎng)液(1640+10%胎牛血清)，1 000 r/min離心3 min，棄上清，加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種入培養(yǎng)瓶，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱、飽和濕度下培養(yǎng),待細(xì)胞完全貼壁后，用PBS液清洗細(xì)胞3遍，更換培養(yǎng)液。1～2 d換液1次。每日倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，鋪滿瓶底時采用25%胰酶按常規(guī)方法消化、傳代。

2.2 含藥血清的制備 取SD健康大鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機分為胃安寧低(2 g/kg)、中(4 g/kg)、高(8 g/kg)劑量組及對照組，每組10只，灌胃給藥,給藥體積為10 mL/kg,對照組給予等體積飲用水，每日給藥1次，連續(xù)7 d，末次灌胃后1 h在無菌條件下,腹主動脈采血，將血液離心制備成含藥血清，56 ℃滅活30 min，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 RT-PCR法測定MGC-803細(xì)胞COX-2 mRNA、VEGF mRNA表達(dá)量 選擇處于對數(shù)生長的MGC-803細(xì)胞,用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞。以1640培養(yǎng)液(含10%FBS)制成細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞的密度為1×105/mL，接種于6孔板中，待長到80%融合時，收取含藥血清培養(yǎng)48 h細(xì)胞及空白血清培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行mRNA抽提、標(biāo)記、雜交和掃描檢測：分別取2組細(xì)胞，加適量Trizol勻漿，3 000 r/min，離心10 min，取上清液加入氯仿，振蕩后放置3 min，向上清液中加異丙醇充分混勻再3 000 r/min，離心10 min，加入2次75%乙醇，離心棄上清，加入Milli-Q(Rnase-free)完全溶解RNA沉淀,-80 ℃保存。取1 μg總RNA行RT-PCR擴(kuò)增，操作步驟按試劑盒要求進(jìn)行。COX-2引物序列為：上游引物5’-CCATGTCAAAACCGTGGTGAAT-3’,下游引物5’-ATGGGAGTTGGGCAGTGATCA-3’，片段長度為374 bp。VEGF引物序列為:上游引物5’-GGTGAGAGGTCTAGTTCCGAAC-3’，下游引物5’-CCATGAACTTACTGCTCTTCTT-3’，片段長度為115 bp。內(nèi)對照為β-actin引物序列為：上游引物5’-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’，下游引物5’-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3’引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃預(yù)變性45 s；72 ℃延伸30 s，退火溫度為58 ℃、時間30 s；循環(huán)30次;取6 μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖中電泳。EB染色后在紫外燈下，用凝膠成像分析系統(tǒng)對凝膠電泳照片進(jìn)行量化分析,每個標(biāo)本以β-actin為內(nèi)對照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析后，比較它們的表達(dá)量的變化。

3 實驗結(jié)果

采用RT-PCR法測定MGC-803細(xì)胞COX-2 mRNA、VEGF mRNA表達(dá)量,結(jié)果顯示胃安寧含藥血清干預(yù)MGC-803細(xì)胞48 h后，小、中劑量含藥血清組中COX-2 mRNA表達(dá)量明顯降低,與空白血清對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；大劑量含藥血清組中COX-2 mRNA表達(dá)量的變化不明顯(P>0.05)，見圖1。胃安寧含藥血清干預(yù)MGC-803細(xì)胞48 h后，各劑量含藥血清組中VEGF mRNA表達(dá)量與空白血清對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

4 討論

胃癌是我國發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤，其病理機制是一多因素參與的復(fù)雜過程，而轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最具破壞性的本質(zhì)所在，因此探討胃癌轉(zhuǎn)移機制，尋求抗胃癌轉(zhuǎn)移新靶點及藥物已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的研究熱點。

A：電泳圖；B：電泳圖光密度比值；與對照組比較，#P<0.05。

A：電泳圖；B：電泳圖光密度比值。

COX-2(環(huán)氧化酶-2)是炎癥過程中的一個重要誘導(dǎo)酶，與COX-l共同參與前列腺素(prostaglandin，PG)的生物合成。有研究表明COX-2 可使e-黏連素和轉(zhuǎn)化生長因子P(TGF-P)的受體下調(diào)，也可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)和膜型金屬蛋白酶，而促進(jìn)癌細(xì)胞的脫落和在周圍的淋巴管、淋巴結(jié)中黏附，增強腫瘤的致癌力和侵襲力。并且通過以上機制增加胃癌細(xì)胞的侵襲力而促進(jìn)淋巴結(jié)浸潤和轉(zhuǎn)移。因此，COX-2可能參與了胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如Tsujii等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在COX-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞可伴有MMPs表達(dá)的顯著增高，并發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)移侵襲活性較不伴有MMPs表達(dá)者增強，該作用在體外可被特異性COX-2抑制劑所逆轉(zhuǎn)。馬丹等[3]研究發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑SC236能明顯抑制裸鼠胃癌原位移植瘤模型移植瘤的生長及轉(zhuǎn)移。但目前為止,COX-2促進(jìn)腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的確切分子作用機制尚不清楚。VEGF是目前已識別的新生血管因子中最重要的一種，其表達(dá)與腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)。VEGF通過與內(nèi)皮細(xì)胞上特殊受體作用，直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞分化增殖和遷移，增加微血管通透性，促使血漿纖維蛋白外滲，誘導(dǎo)蛋白溶解酶的生成，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為轉(zhuǎn)移灶的形成提供必要的途徑和血供，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

胃安寧顆粒是課題組針對胃癌術(shù)后轉(zhuǎn)移脾胃虛弱、氣血虧損、瘀毒內(nèi)結(jié)這一病機，在長期臨床實踐中，不斷精煉而成的中藥抗癌復(fù)方顆粒劑，主要具有健脾活血解毒功效。其主要組成包括黃芪、白花蛇舌草、苦參、薏苡仁、仙鶴草、玄參等中藥[4]。方中白花蛇舌草、苦參、仙鶴草、玄參等經(jīng)研究有明確的抗癌作用，如曾永長等[5]對白花蛇舌草水提部位體內(nèi)外抗腫瘤實驗研究,發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草在體外可顯著抑制HepG2、HCT-116腫瘤細(xì)胞的增值，體內(nèi)能抑制荷瘤小鼠S180肉瘤生長。本課題組前期研究表明胃安寧能下調(diào)人胃癌MGC-803細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞早期凋亡；本次實驗結(jié)果顯示胃安寧含藥血清能抑制COX-2 mRNA的表達(dá)，但對VEGF mRNA表達(dá)量未見有明顯的影響。

綜合以上，胃安寧的抗胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移作用可能與下調(diào)COX-2的表達(dá)相關(guān)，但腫瘤轉(zhuǎn)移這一生物過程受到多種細(xì)胞因子和腫瘤相關(guān)基因的控制，因此其具體作用機制還有待進(jìn)一步深入研究。

[1]何立麗,孫桂芝,張培影.胃癌的病因病機研究進(jìn)展[J].北京中醫(yī),2009,28(3):234-236.

[2]Tsujii M,Dubios RN,Alterations in cellular adhesion and apotosis in epithelial cells over expressing prostaglandin endoperxide synthase 2[J].Cell,1995,83(3):493-501.

[3]馬丹,劉敏,梁平.環(huán)氧合酶-2抑制劑抑制胃癌轉(zhuǎn)移的實驗研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2006,35(20):1875-1876.

[4]顏延鳳.許尤琪教授治療胃癌經(jīng)驗[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011,27(6):943-944.

[5]曾永長,梁少瑜,羅佳波,等.白花蛇舌草水提部位體內(nèi)外抗腫瘤實驗研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2011(5):521-524.