譚美華，陳建蘇

(1.暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院眼科;2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院眼科研究所，廣東廣州510632)

體外細(xì)胞組織重建中共培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

譚美華1，陳建蘇2*

(1.暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院眼科;2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院眼科研究所，廣東廣州510632)

細(xì)胞共培養(yǎng)體系在維持細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)和性狀的基礎(chǔ)上，通過兩種或多種細(xì)胞組織的相互作用，使體內(nèi)外環(huán)境盡可能相吻合，彌補(bǔ)了單層細(xì)胞培養(yǎng)的缺陷，有利于構(gòu)建更加接近生理狀態(tài)的重建體外細(xì)胞組織，被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代細(xì)胞研究，成為角膜、牙周、軟骨、心血管以及神經(jīng)細(xì)胞組織等體外構(gòu)建的重要技術(shù)應(yīng)用。在干細(xì)胞研究中，多孔膜兩側(cè)直接接觸共培養(yǎng)日益受到重視，三維細(xì)胞共培養(yǎng)將是未來發(fā)展的方向。

細(xì)胞共培養(yǎng);干細(xì)胞;組織工程

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成為當(dāng)今生命科學(xué)各研究領(lǐng)域的一項(xiàng)基礎(chǔ)技術(shù)和技能，是細(xì)胞工程、基因工程和生物醫(yī)學(xué)工程的重要研究手段。細(xì)胞離體后獨(dú)立生存于人工培養(yǎng)環(huán)境中，和體內(nèi)對應(yīng)細(xì)胞在行為上的許多差異主要源于體外培養(yǎng)的細(xì)胞喪失了三維幾何的空間環(huán)境，組織學(xué)所特有的異型性細(xì)胞間相互作用不復(fù)存在。20世紀(jì)80年代后期發(fā)展的細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)是將兩種或兩種以上的細(xì)胞或細(xì)胞與載體培養(yǎng)于同一環(huán)境中的技術(shù)，建立的培養(yǎng)體系在維持細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)和性狀的基礎(chǔ)上，更加注重多種細(xì)胞組織在三維空間的相互作用，使體內(nèi)外環(huán)境盡可能相吻合，彌補(bǔ)了單層細(xì)胞培養(yǎng)的缺陷，被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代細(xì)胞研究中。更好地觀察細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用及可增加干細(xì)胞分化的可塑性，使得共培養(yǎng)技術(shù)在體外細(xì)胞組織重建的應(yīng)用更加廣泛。

1 細(xì)胞共培養(yǎng)體系建立的方法

1.1 二維共培養(yǎng)

1.1.1 直接接觸共培養(yǎng):1)多微孔膜兩側(cè)細(xì)胞接觸共培養(yǎng)。通過插入式培養(yǎng)皿小室底部多孔膜的孔徑使兩側(cè)細(xì)胞直接接觸，既有可溶性分泌因子的相互交流，又能形成兩側(cè)細(xì)胞胞質(zhì)間的連接，同時(shí)能限制細(xì)胞的遷移，這些優(yōu)勢使得這種培養(yǎng)方式日益受到重視。在插入小室底部聚酯膜的內(nèi)外兩側(cè)分別接種人髓核細(xì)胞和自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchyme stem cell，BMSCs)進(jìn)行直接接觸共培養(yǎng)，髓核細(xì)胞增殖、DNA合成和蛋白多糖含量均顯著增加，BMSCs能夠增強(qiáng)髓核細(xì)胞的生物活性，對共培養(yǎng)后的髓核細(xì)胞進(jìn)行檢驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)有染色體異常及腫瘤形成，為該模型應(yīng)用于人體內(nèi)移植提供了更加有力的證據(jù)［1］。多孔膜兩側(cè)接種人胚胎干細(xì)胞和人脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)，可使胚胎干細(xì)胞在保持干細(xì)胞特性的同時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)增，且與飼養(yǎng)層細(xì)胞分離，避免了傳代過程中酶的使用和飼養(yǎng)層細(xì)胞的污染，并用人脂肪干細(xì)胞代替了傳統(tǒng)的動(dòng)物細(xì)胞，增加了胚胎干細(xì)胞應(yīng)用于臨床的可靠性［2］。2)混合細(xì)胞共培養(yǎng)。在一定條件下將兩種或兩種以上細(xì)胞以一定比例接種在同一培養(yǎng)皿中，使不同種類細(xì)胞直接接觸，是較早應(yīng)用的直接接觸共培養(yǎng)方法。在經(jīng)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞中加入小鼠神經(jīng)細(xì)胞瘤與大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤之融合細(xì)胞NG108-15細(xì)胞株，共培養(yǎng)后NG108-15細(xì)胞中有神經(jīng)突起的細(xì)胞數(shù)、每個(gè)細(xì)胞的神經(jīng)突起數(shù)和最長突起的長度與單獨(dú)培養(yǎng)相比均有增加，表明脂肪干細(xì)胞能夠促進(jìn)神經(jīng)突的生長和延長［3］。通過建立大鼠BMSCs與平滑肌細(xì)胞的各種共培養(yǎng)體系，觀察到只有兩種細(xì)胞直接接觸可誘導(dǎo)BMSCs向平滑肌細(xì)胞分化［4］。

1.1.2 非直接接觸式共培養(yǎng):將插入式培養(yǎng)皿放入相應(yīng)規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)板中，上下兩層接種不同的細(xì)胞，通過培養(yǎng)液的成分相通作用，觀察一種細(xì)胞對另一細(xì)胞的影響，是目前常用的一種共培養(yǎng)方式。在非直接接觸共培養(yǎng)模型中脂肪干細(xì)胞可通過旁分泌作用促進(jìn)鼓膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移，有利于鼓膜纖維層的修復(fù)［5］。為研究BMSCs的分化狀態(tài)對軟骨細(xì)胞行為的影響，對BMSCs進(jìn)行不同處理后與軟骨細(xì)胞非直接接觸共培養(yǎng)，觀察到用成骨細(xì)胞培養(yǎng)基或基礎(chǔ)培養(yǎng)基前期誘導(dǎo)分化4 d的BMSCs可使軟骨細(xì)胞的黏多糖顯著增加［6］。

1.2 三維細(xì)胞共培養(yǎng)

三維培養(yǎng)中細(xì)胞通過緊密連接或縫隙連接等方式建立聯(lián)系，在基因表達(dá)、基質(zhì)分泌及細(xì)胞功能活動(dòng)等方面與二維培養(yǎng)均有明顯差異，而與體內(nèi)細(xì)胞生長情況更為相似。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與人肝細(xì)胞放在合成的聚醚醚酮-聚氨酯及殼聚糖膜上建立共培養(yǎng)系統(tǒng)，膜的一些特性可促進(jìn)細(xì)胞黏附并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)形成以及ECM蛋白分泌，此共培養(yǎng)系統(tǒng)可顯示肝臟的分泌功能并用于肝臟組織的生物制造［7］。在自制的聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly(lactic-co-glycolic)acid，PLGA］支架上接種經(jīng)成骨細(xì)胞培養(yǎng)基前期誘導(dǎo)分化的BMSCs，在負(fù)載聚乙二醇［poly(ethylene glycol，PEG)］的水凝膠上接種軟骨細(xì)胞，再將兩種材料聚合進(jìn)行三維共培養(yǎng)，觀察到BMSCs能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞黏多糖增加［6］。

1.3 其他

1)用一種細(xì)胞的培養(yǎng)上清液與另一種細(xì)胞共培養(yǎng)。收集小鼠胚胎干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，以25%的比例加入到角膜內(nèi)皮培養(yǎng)基后培養(yǎng)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，多邊形內(nèi)皮細(xì)胞傳至第6代時(shí)體積不變大，Ki67蛋白陽性細(xì)胞數(shù)、集落形成率、進(jìn)入S和G2期的細(xì)胞數(shù)均高于普通培養(yǎng)組，說明胚胎干細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠增強(qiáng)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力［8］。2)用細(xì)胞裂解液或組織勻漿液與另一種細(xì)胞共培養(yǎng)。將兔角膜緣基質(zhì)制成勻漿再添加DMEM/F12培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞，角蛋白K12明顯表達(dá)，提示角膜緣基質(zhì)勻漿液能提供類似體內(nèi)角膜緣微環(huán)境中的因子，促進(jìn)毛囊干細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化［9］。不同濃度心竇房結(jié)細(xì)胞裂解液與大鼠BMSCs共培養(yǎng)，能夠誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化，且分化后的細(xì)胞具有起搏功能［10］。

2 細(xì)胞共培養(yǎng)在體外細(xì)胞組織重建的應(yīng)用

2.1 在角膜細(xì)胞組織體外重建的應(yīng)用

合適的種子細(xì)胞是組織工程眼表重建技術(shù)的關(guān)鍵之一。建立眶周脂肪干細(xì)胞(orbital fat-derived stem cells，OFSCs)與人角膜上皮細(xì)胞(human corneal epithelial cells，HCE-T)直接混合和非直接接觸兩種二維共培養(yǎng)體系，HCE-T細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)OFSCs設(shè)為對照，發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)組可檢測到部分OFSCs表達(dá)CK19及CK3，而在非直接接觸共培養(yǎng)組及對照組檢測不到，表明OFSCs可分化為角膜上皮細(xì)胞，直接接觸是其分化的必要條件，顯示了其在細(xì)胞治療由角膜上皮細(xì)胞丟失引起的角膜疾病的潛在臨床應(yīng)用［11］。

2.2 在牙周細(xì)胞組織研究的應(yīng)用

BMSCs與牙周韌帶細(xì)胞混合共培養(yǎng)后骨鈣蛋白和骨橋蛋白表達(dá)顯著增加，骨唾液酸糖蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，表明兩種細(xì)胞直接接觸及牙周韌帶細(xì)胞分泌的一些因子可誘導(dǎo)BMSCs獲得牙周韌帶樣的特性，提示BMSCs應(yīng)用于牙周組織再生和修復(fù)的可能［12］。

2.3 在心血管系統(tǒng)的應(yīng)用

將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與BMSCs進(jìn)行非直接接觸共培養(yǎng)，BMSCs可被誘導(dǎo)為內(nèi)皮樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后的細(xì)胞從形態(tài)到表型特征都與成熟內(nèi)皮細(xì)胞相似，傳代擴(kuò)增迅速并能夠在脫細(xì)胞牛頸靜脈血管支架上黏附生長，為BMSCs用于人工血管或瓣膜的細(xì)胞種植提供了一種新的途徑［13］。

2.4 在軟骨細(xì)胞組織體外重建的應(yīng)用

將負(fù)載軟骨細(xì)胞和負(fù)載胚芽來源細(xì)胞的水凝膠聚合進(jìn)行三維共培養(yǎng)，3周后移植到無胸腺雄性裸鼠，6周后取出檢測，胚芽來源細(xì)胞能夠在體內(nèi)繼續(xù)分化，移植物中有細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和新生軟骨形成［14］。軟骨細(xì)胞和BMSCs非接觸共培養(yǎng)能誘導(dǎo)BMSCs分化為較成熟的軟骨細(xì)胞并形成小的軟骨樣組織，有II型膠原的分泌，與條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞相比，共培養(yǎng)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞更有利于作為組織工程軟骨的種子細(xì)胞［15］。

2.5 在神經(jīng)細(xì)胞組織體外重建的應(yīng)用

組織工程神經(jīng)作為移植的替代物，已成為神經(jīng)缺損修復(fù)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。經(jīng)過神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3基因修飾的血旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)與絡(luò)氨酸蛋白激酶C基因修飾的BMSCs共培養(yǎng)于帶有多管道的PLGA導(dǎo)管，可促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，并有突觸樣結(jié)構(gòu)形成，人造BMSCs/SCs/PLGA復(fù)合體有望應(yīng)用于脊髓損傷的治療［16］。

3 問題與展望

細(xì)胞共培養(yǎng)體系能夠增加干細(xì)胞分化的可塑性，構(gòu)建的三維模型更接近于體內(nèi)的真實(shí)環(huán)境，成為近年來組織工程研究的熱點(diǎn)。但共培養(yǎng)體系的建立和應(yīng)用仍存在一些不足，混合共培養(yǎng)模型中兩種細(xì)胞分離較困難，不便于區(qū)別觀察和后續(xù)檢測，需結(jié)合一定的分選技術(shù)。非直接接觸共培養(yǎng)可分別觀察兩種細(xì)胞的形態(tài)變化及得到相對高純度的細(xì)胞進(jìn)行功能檢測，彌補(bǔ)混合培養(yǎng)模式的不足，但它只能通過旁分泌的細(xì)胞因子相互作用，喪失了細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸作用，與體內(nèi)環(huán)境存在一定的差異，相比較而言，利用多微孔膜建立的直接接觸共培養(yǎng)更為理想，既有可溶性分泌因子的相互交流，又能形成兩側(cè)細(xì)胞胞質(zhì)間的連接，同時(shí)能限制細(xì)胞的遷移，在二維細(xì)胞培養(yǎng)中將得到更加廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。而三維細(xì)胞共培養(yǎng)同時(shí)有細(xì)胞間的直接接觸和分泌因子的流通，能夠提供細(xì)胞更充分的立體生長空間，模型更符合生理學(xué)特點(diǎn)，為將來細(xì)胞組織體外重建研究進(jìn)一步添加神經(jīng)和血管的介入奠定了更加堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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The application of cell co-culture in the reconstruction of cells and tissues in vitro

TAN Mei-hua1，CHEN Jian-su2*

(1.Dept．of Ophthalmology，the First Clinical Medical College of Jinan University;2.Eye Institute，Medical College of Jinan University，Guangzhou 510632，China)

Based on maintaining the fundamental structures and properties of cells，the cell co-culture system makes the environmentin vitroto be similar within vivoenvironment as far as possible through interactions of two or more kinds of cells and tissues．So the cell co-culture system makes up for the defects of monolayer cell culture and is conducive to reconstructing cells and tissuesin vitrocloser to the physiological state．The system is widely used in modern cell research，which makes it to be an important technology for the cells and tissues reconstructionin vitroof cornea，periodont，cartilage，cardiovascular，neural，et al．In the field of stem cell research，the co-culture system of direct contact through porous membrane has been paid much attention recently and three-dimensional culture will be the focal point in the future．

cell co-culture;stem cells;tissue engineering

R-331

A

1001-6325(2012)09-1111-04

2011－11－02

2011－12－28

*通信作者(corresponding author):chenjiansu2000@163．com