宮黎明，方 寧，陳代雄*，萬衛(wèi)紅，章 濤，余麗梅，趙春華

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州遵義563003;2.中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所組織工程中心，北京100005)

人羊膜上皮細胞在大鼠受損肝組織中分化為肝細胞

宮黎明1，方 寧1，陳代雄1*，萬衛(wèi)紅1，章 濤1，余麗梅1，趙春華2

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州遵義563003;2.中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所組織工程中心，北京100005)

目的 探討人羊膜上皮細胞在大鼠損傷肝原位植活及向肝細胞分化。方法 用胰蛋白酶消化法從羊膜組織中分離人羊膜上皮細胞(hAECs)，用流式細胞術和免疫熒光染色進行表型分析和細胞鑒定。腹腔注射D-氨基半乳糖溶液建立大鼠肝損傷模型，隨機分為hAECs移植組和對照組，每組20只。造模后24 h用微量注射器于肝左、中、右葉3點分別移植L-DMEM懸浮的hAECs懸液50 μL(約1×106個細胞)，對照組注射等量L-DMEM。于移植后48 h、1、2和4周處死各實驗組5只大鼠，取肝臟制備冰凍切片，用免疫熒光雙染色檢查hAECs在受損肝原位的植活、分布及其向肝細胞分化的標志物表達。結果 1)FCM分析和免疫熒光染色結果顯示，所分離的hAECs表達CD29、CD166及CK19，幾乎不表達CD44、CD80、CD86、HLA-DR及波形蛋白;2)免疫熒光雙染色結果顯示，hAECs移植后1周主要定植于肝小葉且表達AFP，至2周表達CK18，至4周表達Alb。結論 hAECs在大鼠受損肝組織中能被植活且可分化為肝細胞，提示hAECs移植在臨床肝病的治療方面可能具有潛在應用價值。

人羊膜上皮細胞;移植;分化;肝細胞;肝損傷

人羊膜上皮細胞 (human amnion epithelial cells，hAECs)在特定的體外誘導培養(yǎng)條件下，可分化成來自3個胚層的各種細胞，包括神經細胞、心肌細胞、成骨和軟骨細胞、胰島素分泌細胞等［1－5］。提示 hAECs在細胞替代治療方面具有廣闊的應用前景。但是，作為細胞替代治療的供體細胞hAECs還有很多問題，如在病損組織原位向特化功能性細胞的分化能力、對病損器官的修復和功能重建能力、生物安全性等值得探討。為了評價hAECs在病損組織中的分化潛能，本實驗以大鼠實驗性肝損傷為受試模型，觀察其在肝原位向功能性肝細胞分化的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

經產婦知情同意后，無菌采集健康足月剖宮產胎盤。清潔級SD雌性大鼠40只，體質量(200±20)g(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院動物實驗中心［許可證號:SCXK(渝)2007-017］)，實驗中動物處置符合2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規(guī)定。胰蛋白酶(Amreseo公司);胎牛血清(fatal bovine serun，F(xiàn)BS)和 LG-DMEM(Gibco公司);CD29-PE-Cy5、CD44-PE、 CD80-FITC、 CD86-PE、CD166-PE、HLA-DR-PerCP和小鼠 IgG1-PE(BD公司);D-氨基半乳糖(江蘇啟東市久豐工貿有限公司);鼠抗人CK19抗體(Gene Tech公司);鼠抗人波形蛋白抗體、兔抗人CK18抗體和兔抗人AFP抗體(Sigma公司);MAB1281抗體(鼠抗人細胞核抗體)(Millipore公司);兔抗人Alb抗體、羊抗鼠IgG-FITC和羊抗兔IgG-Texas Red(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 hAECs的分離和培養(yǎng):無菌條件下，用機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-PBS液反復沖洗，剪碎羊膜，加入含0.5 g/L胰蛋白酶+EDTA消化液，37℃旋轉(200 r/min)消化10 min，棄上清，再加消化液，37℃旋轉消化30 min，300目不銹鋼濾網過濾，收集細胞濾液，加入等體積含10%胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)基終止消化。組織碎片再重復消化2次。合并3次消化所得的hAECs懸液，1 500 r/min離心10 min，細胞沉淀懸浮于LG-DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、2 mmol/L的L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、55 μmol/L的 2-巰基乙醇、1 mmol/L丙酮酸鈉、10 μg/L表皮生長因子、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素)，以1.25×108/L濃度接種于培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，3 d更換新的培養(yǎng)基。hAECs連生面積達80% ～90%后，用2.5 g/L胰蛋白酶+EDTA溶液消化，收集細胞進行鑒定及傳代培養(yǎng)。

1.2.2 流式細胞儀檢測:取新鮮分離的hAECs用0.1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS調細胞濃度至1×106/mL，取細胞懸液200 μL分別加入10 μL熒光標記人單抗 CD29-PE-Cy5、CD44-PE、CD80-FITC、CD86-PE、CD166-PE 和 HLADR-PerCP混勻，室溫避光孵育25～30 min，每管加入2 mL含0.1%疊氮鈉的PBS，混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清，振蕩重懸細胞，每管加入300 μL含1%多聚甲醛的 PBS溶液，混勻，用流式細胞儀(FACS Calibur，BD公司)檢測，每一樣品采集細胞數(shù)≥20 000個，用Cellquest軟件采集和分析。同型對照為相應熒光素標記的小鼠IgG。

1.2.3 免疫熒光染色:hAECs接種于預置蓋玻片的24孔板中，制備細胞爬片。細胞爬片用PBS振蕩洗滌3次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS沖洗，0.3%Triton-X100室溫下作用15～20 min，PBS沖洗。1%BSA封閉30 min，PBS沖洗，加鼠抗人細胞角蛋白19(cytokeratin 19，CK19)抗體或鼠抗人波形蛋白抗體，37℃孵育30 min，PBS沖洗，加入FITC標記的羊抗鼠IgG，37℃孵育30 min，PBS沖洗，90%甘油封固，熒光顯微鏡(BX5 Video Test-FISH2.0，Olympus公司)下觀察。陰性對照以PBS代替一抗。

1.2.4 肝損傷模型制備和hAECs移植:標準飼料喂養(yǎng)大鼠，不限飲水，飼養(yǎng)1周后用于實驗。術前12 h禁食，D-氨基半乳糖(400 mg/kg)溶液一次性腹腔內注射制備肝損傷模型［6］，隨機分為hAECs移植組和對照組，每組20只。參照文獻［7］方法，造模后24 h，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，常規(guī)備皮、消毒，沿腹正中切口開腹，暴露肝臟，用微量注射器與肝平面45度角進針，深度約0.5 cm，肝內緩慢注射，留針時間1 min，移植組于肝左、中、右葉3點分別注射用LG-DMEM懸浮的P3代hAECs細胞懸液50 μL(約1×106個細胞)，對照組注射等量的LG-DMEM，棉球壓迫止血，關腹。術后注意保暖，給予糖鹽水飲用。

1.2.5 hAECs在肝內定植及分化標志物的檢測:各實驗組于移植后1、2和4周處死大鼠5只，切取約1 cm×2 cm大小含移植部位的肝組織，OCT包埋劑包埋，冰凍切片8 μm，冷丙酮固定10 min，室溫晾干，PBS沖洗，0.3%的 Triton-X100室溫 15～20 min，3%H2O2室溫避光孵育10 min，PBS沖洗，山羊血清室溫封閉30 min，棄封閉液，進行人細胞核與甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)或細胞角蛋白18(cytokeratin18，CK18)或白蛋白(albumin，Alb)免疫熒光雙染色:滴加混合抗體(MAB1281抗體+兔抗人AFP抗體，或 MAB1281抗體 +兔抗人 CK18抗體，或MAB1281抗體+兔抗人Alb抗體)，37℃孵育1 h，PBS沖洗;滴加FITC標記的羊抗鼠 IgG與 Texas Red標記的羊抗兔IgG混合二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，抗熒光衰減劑封片，熒光顯微鏡下觀察。陰性對照用PBS替代一抗。

2 結果

2.1 hAECs的生長特性與表型特征

hAECs原代(P0)培養(yǎng)第3天以后貼壁細胞數(shù)量迅速增多，形態(tài)多為卵圓形和三角形;傳代培養(yǎng)的hAECs較原代容易貼壁，且增殖速度加快，4～5 d細胞匯合率可達90%以上，細胞形態(tài)變化不大，呈鋪路石樣排列(圖1)。

FCM分析表明，新鮮分離的 hAECs高表達CD29(98.91% ±0.97%)和CD166(97.33% ±1.01%)，幾乎不表達 CD44(0.58% ±0.21%)、CD80(0.34% ±0.15%)、CD86(0.25% ±0.07%)及 HLA-DR(0.18% ±0.12%)(圖2)。

免疫熒光染色結果顯示，經過傳代純化后的hAECs均表達CK19(圖3)，但不表達波形蛋白。

2.2 hAECs肝損傷原位移植后的植活與分布

MAB1281抗體免疫熒光染色顯示，移植后48 h可見大量hAECs植活，主要分散于肝小葉內的肝血竇中，中央靜脈亦可見hAECs(圖4)。

2.3 hAECs肝原位移植后向肝細胞分化的特征

免疫熒光雙染色顯示，hAECs肝原位移植后1周表達AFP(圖5A～C)，移植后2周表達CK18(圖5D～F)，移植后2和4周表達Alb(圖5G～I)。

3 討論

圖1 hAECs培養(yǎng)形態(tài)Fig 1 Morphology of cultured hAECs(×200)

圖4 hAECs肝損傷原位移植后48 h的植活與分布Fig 4 The survival and distribution of transplantation hAECs into rat injured liver at 48 h after being transplanted(×100)

原代hAECs的表面標志因受酶消化影響較大，通過流式細胞儀分析的表型特征描述報道不一，本室對原代hAECs的表型鑒定常規(guī)采用流式細胞儀分析和上皮細胞標志CK19免疫細胞化學染色。本實驗分離的目標細胞高表達CD29和CD166，不表達 CD44、CD80、CD86 和 HLA-DR;表達 CK19，不表達波形蛋白。說明實驗所分離的目標細胞為較高純度的hAECs。鑒于羊膜間充質細胞具有先于上皮細胞貼壁的特性，可通過傳代培養(yǎng)進一步純化后用于后續(xù)的移植實驗。

已有研究證明，hAECs同種異體和異種間移植不會引起排斥反應［1］。本實驗人細胞核免疫熒光染色結果顯示，移植后48 h肝小葉區(qū)內可見大量人細胞核陽性細胞，說明hAECs肝原位移植后在一定時間內可以植活而不被排斥，這可能與其不表達MHC-Ⅱ類抗原HLA-DR和共刺激分子(CD80和CD86)有關。顯然，hAECs的這種免疫赦免特性非常有利于其同種異體間的移植。

圖5 hAECs肝原位移植后AFP、CK18和Alb的表達Fig 5 The expression of α-fetoprotein，cytokeratin18 and albumin after injecting hAECs into rat injured liver(×400)

已有研究報道，在體外誘導條件下hAECs可分化為肝細胞樣細胞或肝上皮樣細胞，人羊膜片移植入SCID小鼠腹腔后可分泌 Alb，經門靜脈移植hAECs給SCID小鼠后2周，肝組織表達人Alb和AFP［8－10］。本實驗以 D-氨基半乳糖致大鼠肝損傷模型作為hAECs原位移植受體，肝組織免疫熒光雙染色結果顯示，hAECs移植后1、2和4周依次表達肝細胞相關標志物AFP、CK18及Alb，表明hAECs在損傷肝原位可向肝細胞分化。至于hAECs移植能否再生修復病損肝臟并重建肝功能，有待進一步通過大動物模型治療實驗進行組織學和功能學的評價。關于供體細胞在肝原位分化為肝細胞的機制尚不明確，通過細胞融合或細胞轉分化路徑是目前比較流行的觀點。hAECs向肝細胞分化是通過細胞融合，還是轉分化誘導機制，值得探究。

［1］Parolini O，Alviano F，Bagnara GP，et al．Isolation and characterization of cells from human term placenta:outcome of the first international workshop on placenta derived stem cells［J］．Stem Cells，2008，26:300 －311．

［2］Ilancheran S，Michalska A，Peh G，et al．Stem cells derived from human fetal membranes display multi-lineage differentiation potential［J］．Biol Reprod，2007，7:577 －588．

［3］張路，方寧，陳代雄，等．人羊膜上皮細胞有向心肌樣細胞分化的特性［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2008，12:401 －405．

［4］宋秀軍，陳代雄，方寧，等．人羊膜上皮細胞分化為成骨細胞的特性［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2008，12:7518－7521．

［5］Hou Y，Huang Q，Liu T，et al．Human amnion epithelial cells can be induced to differentiate into functional insulinproducing cells［J］．Acta Biochim Biophys Sin，2008，40:830－839．

［6］劉霞，王泰齡，趙靜波，等．D-半乳糖胺致大鼠急性肝損傷模型制作的改進［J］．中日友好醫(yī)院學報，1996，10:305－308．

［7］Sato Y，Araki H，Kato J，et al．Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion［J］．Blood，2005，106:756－763．

［8］史明霞，李維佳，李炳宗，等．人羊膜來源成體干細胞的多向分化潛能［J］．生物工程學報，2009，25:754－760．

［9］Takashima S，Ise H，Zhao P，et al．Human amniotic epithelial cells possess hepatocyte-like characteristics and functions［J］．Cell Struct Funct，2004，29:73 －84．

［10］Sakuragawa N，Enosawa S，Ishii T，et al．Human amniotic epithelial cells are promising transgene carriers for allogeneic cell transplantation into liver［J］．J Hum Genet，2000，45:171－176．

Differentiation of human amnion epithelial cells into hepatocytes in rat injured liver

GONG Li-ming1，F(xiàn)ANG Ning1，CHEN Dai-xiong1*，WAN Wei-hong1，ZHANG Tao1，YU Li-mei1，ZHAO Chun-hua2

(1.Key Laboratory of Cell Engineering of Guizhou Province，Affiliated Hospital of Zunyi Medcial College，Zunyi 563003;2.Tissue Engineering Center，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100005，China)

ObjectiveTo investigate the survival and differentiation into hepatocytes of hAECs in rat．MethodshAECs were isolated from human amnion treated with trypsin，and the phenotype and characteristics of immunocytochemistry were analyzed by FCM and immunofluorescence staining．Healthy and clean grade female SD rats were administered intraperitoneal injection of D-galactosamine diluted in normal saline at a dose of 400 mg/kg body weight，to establish liver injury model．Rats were then devided into hAECs group and control group stochastically，with twenty in each group．Twenty-four hours after modeling，50 μL cell suspension(approximately 1 ×106cells suspended in L-DMEM)of hAECs was injected slowly into the left，middle and right lobe respectively with micro-syringe，while equivalent volume of L-DMEM injected into the control group．Results1)Freshly isolated hAECs expressed CD29 and CD166;immunofluoresce staining showed that cytokeratin 19 was positive in hAECs，while vimentin was negative．2)hAECs transplanted into injured liver were located in hepatic lobules at 48 h，and expressed AFP at 1w，CK18 at 2w，and Alb at 4w after transplantation．ConclusionshAECs xenografted to rat injured liver can differentiate into hepatocytes suggesting hAECs may have the potential value for treating clinical liver injury．

human amnion epithelial cell;transplantation;differentiation;hepatocyte;liver injury

Q 813;R 318

A

1001-6325(2012)09-0998-06

2011－04－21

2011－12－26

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(2009ZX09503－025);貴州省科技計劃發(fā)展項目(黔科合計字2051號;黔科合SZ字3017號)

*通信作者(corresponding author):cellgene@163．com