焦文學(xué)，王 潔（甘肅省隴南市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 453000）

近年來(lái)研究表明，同型半胱氨酸（Hcy）與冠心病、腦卒中、彌漫性腦動(dòng)脈硬化、糖尿病腎病等疾病關(guān)系甚為密切［1-2］。最早檢測(cè)Hcy是氨基酸分析法，Ueland等測(cè)定血清中Hcy，后經(jīng)改良，目前常用方法為高效液相色譜法（HPLC）、熒光偏振免疫檢測(cè)法（FPIA）和酶免疫分析法（EIA）。HPLC是經(jīng)典的參考方法，其操作比較復(fù)雜、試驗(yàn)耗時(shí)比較長(zhǎng)、試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異比較大，在臨床應(yīng)用方面逐漸被FPIA和EIA所取代。但FPIA存在價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)，EIA存在大部分操作還是手工操作，比較耗時(shí)等缺點(diǎn)［3］，所以兩種方法不適用于各級(jí)實(shí)驗(yàn)室，尤其是基層醫(yī)療單位的推廣。近年來(lái)，由于Hcy檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)其研究逐漸深入，循環(huán)酶法因?yàn)榫哂锌焖佟⒑?jiǎn)便、靈敏度高，易于自動(dòng)化等特點(diǎn)，逐漸成為適用于各級(jí)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)方法。本文對(duì)循環(huán)酶法雙試劑測(cè)定血清Hcy進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選擇2010年1月至2011年11月本院門診和住院的患者97例，其中男52例，女45例，年齡31～86歲，平均（41.7±10.3）歲。

1.2 儀器與試劑 日立7180型全自動(dòng)生化分析儀。Hcy檢測(cè)試劑（浙江伊利康生物技術(shù)有限公司）包括試劑Ⅰ：腺苷甲硫氨酸（濃度為0.1mmol／L）、三（2－羧乙基）磷氯化氫（濃度為0.5mmol／L）、谷氨酸脫氫酶（20 k U／L）；試劑Ⅱ：Hcy水解酶（3.0 k U／L）、Hcy基轉(zhuǎn)移酶（3.0 k U／L）；2個(gè)水平的 Hcy標(biāo)準(zhǔn)液（分別為0.0和28.0μmol／L）。

1.3 測(cè)定原理 樣品中的氧化型Hcy被還原劑還原成游離型Hcy，游離型Hcy與試劑中的底物和酶發(fā)生反應(yīng)引起吸光度變化，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)中的吸光度變化的速率，可以計(jì)算出待測(cè)樣本中Hcy的濃度。

1.4 測(cè)定方法 生化分析儀基本參數(shù)設(shè)置：反應(yīng)類型為速率A法；波長(zhǎng)340 nm（主）／405 nm（副）；37℃反應(yīng)10min，讀數(shù)時(shí)間23～31點(diǎn)，樣品量8μL，R1量125μL，R2量25μL。

1.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo) 進(jìn)行方法的回收試驗(yàn)、干擾試驗(yàn)，精密度、線性范圍及方法對(duì)比試驗(yàn)。

1.5.1 精密度評(píng)價(jià) 按照 NCCLS（EP5－T2）文件的評(píng)價(jià)方案，取濃度為12.0和28.0μmol／L的 Hcy質(zhì)控品各一份，用循環(huán)酶法將此兩份標(biāo)本每天上午、下午雙份測(cè)定，連續(xù)20 d。

1.5.2 回收試驗(yàn) 向500μL血清中加入50μL的生理鹽水作為基礎(chǔ)樣本，測(cè)得Hcy濃度為8.5μmol／L，向同體積的血清標(biāo)本中分別加入50μL的濃度為50.0和200.0μmol／L的Hcy純品，使其終濃度分別為12.3和25.9μmol／L，每一濃度作平行管。

1.5.3 線性試驗(yàn) 取高值樣本用蒸餾水稀釋成5個(gè)不同濃度的樣本，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算出回歸方程Y＝a＋b X及線性誤差（相關(guān)系數(shù)）r2。

1.5.4 干擾試驗(yàn) 以濃度為12.3μmol／L的 Hcy為基礎(chǔ)血清，加入不同濃度的干擾物，同時(shí)對(duì)相同體積的蒸餾水作為基礎(chǔ)樣品，同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加入干擾物質(zhì)后的測(cè)定結(jié)果與基礎(chǔ)樣本的測(cè)定結(jié)果之間的偏差。

1.5.5 方法比較 選擇 Hcy濃度在5.2～65μmol／L的臨床血清標(biāo)本30份，分別用本法（Y）和酶免疫分析法（X）測(cè)定，每份樣品作雙份測(cè)定，結(jié)果取均值。

1.5.6 參考值范圍測(cè)定 選用150名體檢結(jié)果正常、肝腎功能試驗(yàn)等各項(xiàng)理化指標(biāo)正常的門診體檢者的空腹血清標(biāo)本，年齡在17～63歲之間，其中，男92例，女58例。

2 結(jié) 果

2.1 精密度及回收率 結(jié)果批內(nèi)CV分別為2.85%、1.88%；日間 CV 分別 為4.26%、3.19%，總 CV 分別 為6.35%、5.33%。測(cè)得其回收率為93.5%～97.7%。

2.2 線性試驗(yàn)及干擾試驗(yàn) 線性相關(guān)方程Y＝0.982 1 X＋0.054 7，r2＝0.999 6。干擾試驗(yàn)結(jié)果表明，三酰甘油濃度小于或等于10mmol／L，血紅蛋白濃度小于或等于4.5 g／L，維生素C濃度小于或等于500 mg／L，膽紅素濃度小于或等于300 μmol／L時(shí)，血氨小于或等于70μmol／L時(shí)，偏差均小于5.0%，說(shuō)明上述濃度的物質(zhì)無(wú)明顯干擾。

2.3 與ELA比較 本法和ELA比較，Y＝1.040 0 X－0.549 8，r2＝0.995 9，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 參考值范圍測(cè)定 Hcy結(jié)果的頻數(shù)分布均為非正態(tài)性分布，男女之間結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。取95%置信區(qū)間確定的參考范圍為：男性4～18μmol／L，女性2～13 μmol／L。

3 討 論

Hcy是人體內(nèi)含硫氨基酸的一個(gè)重要的代謝中間產(chǎn)物、可能是動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因子。血漿中Hcy含量與遺傳因素、營(yíng)養(yǎng)因素、雌激素水平、年齡因素等有關(guān)，與Hcy代謝有關(guān)的N5N10－亞甲基四氫葉酸還原酶和胱硫醚－β－合成酶的基因突變，酶活性下降，也可引起高Hcy血癥［5］。血清Hcy濃度測(cè)定近年來(lái)受到廣泛重視，本試驗(yàn)所應(yīng)用的酶速率法測(cè)定血清Hcy反應(yīng)原理基于小分子捕獲技術(shù)SMT的S－腺苷Hcy水解酶在TCEP作用下［5］，氧化型Hcy轉(zhuǎn)化為游離型 Hcy，游離型Hcy與共價(jià)底物S－腺苷甲硫氨酸（SAM）催化反應(yīng)形成甲硫氨酸與S－腺苷同型半胱氨酸（SAH）。SAH被SAH水解酶水解成腺苷和Hcy，形成的Hcy可以循環(huán)加入反應(yīng)，從而放大了檢測(cè)信號(hào)。本研究取95%置信區(qū)間確定的參考范圍為：男性4～18μmol／L，女性2～13 μmol／L，與文獻(xiàn)［6］有一定差距。為利用酶促反應(yīng)及還原性輔酶Ⅰ的變化來(lái)測(cè)定血清Hcy的一種嶄新的化學(xué)性方法，做到從免疫到化學(xué)的過(guò)渡，本法與之前所使用的循環(huán)酶法比較，以前是采用三試劑，而現(xiàn)在采用的是雙試劑，更適合在多種自動(dòng)化分析儀上測(cè)定，靈敏度高，線性范圍寬，抗干擾因素強(qiáng)，精密度較好，值得各級(jí)醫(yī)院推廣使用。

［1］顧炳權(quán)，王多寧.血漿同型半胱氨酸水平及臨床診斷意義［J］.中國(guó)血液流變學(xué)雜志，2004，14（4）：630－634.

［2］肖飛，郭健.血液中同型半胱氨酸的檢測(cè)及意義［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2000，18（1）：56－57.

［3］呂偉標(biāo)，羅玲.檢測(cè)同型半胱氨酸的方法學(xué)進(jìn)展和評(píng)價(jià)［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，7（7）：175－176.

［4］胡紅巖，劉建剛，崔云龍，等.血液同型半胱氨酸的測(cè)定方法及臨床意義［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，1999，20（6）：254－255.

［5］Roberts RF，Roberts WL.Performance characteristics of a recombinant enzymatic cycling assay for quantification of total homocysteine in serum or plasma［J］.Clin Chim Acta，2004，344（1－2）：95－99.

［6］Malinow MR，Bostom AG，Krauss RM.Homocyst（e）ine，diet，and cardiovascular diseases：a statement for healthcare professionals from the Nutrition Committee，American Heart Association［J］.Circulation，1999，99（1）：178－182.