張新永，郭華春，趙昶靈

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)薯類作物研究所，云南 昆明 650201）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是僅次于小麥、水稻和玉米的世界第四大糧食作物[1-2]，明朝中后期傳入我國(guó)，復(fù)雜氣候和生態(tài)條件使馬鈴薯分化出諸多品系，出現(xiàn)相當(dāng)數(shù)量的彩色馬鈴薯，使我國(guó)的馬鈴薯種質(zhì)資源庫(kù)更加豐富[3-5]。彩色馬鈴薯塊莖的顏色主要是由于其周皮和皮層存在花色苷的結(jié)果，花色苷是植物次生代謝過程中產(chǎn)生的黃酮類物質(zhì)[6-7]，對(duì)于植物自身而言，花色苷類物質(zhì)能夠顯著提高其抗UVB輻射、抗寒、抗旱、抗氧化等方面的能力[8-9]；對(duì)人類而言，花色苷具有抗氧化活性、抗衰老、防止血管硬化的功能，還是一種潛在的抗癌化合物，可作為食品、藥品和化妝品的天然色素[10-12]，因此，利用傳統(tǒng)雜交技術(shù)和分子育種技術(shù)培育彩色馬鈴薯新品種的研究逐漸受到重視[13-17]。

1 馬鈴薯塊莖花色苷生物合成途徑的研究現(xiàn)狀

花色苷由“一般苯丙烷類途徑”合成[18-20]（圖1），合成過程需要數(shù)種酶基因的參與才能夠完成，經(jīng)過研究已經(jīng)探明的有苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）、類黃酮-3′-羥化酶基因（F3′H）和類黃酮-3′,5′-羥化酶基因（F3′5′H）、花色素合成酶基因（ANS）、查耳酮合酶基因（CHS）、黃烷酮3-羥化酶基因（F3H）、二氫黃酮醇-4-還原酶基因（DFR）和UDP-葡萄糖：類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶基因（3GT）等多種酶基因[21-25]。

圖1 花色苷生物合成途徑Figure 1 The way of anthocyanin biosynthesis

絕大部分彩色馬鈴薯塊莖的皮色和肉色是紅色或者紫色。Howard等[26]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯塊莖的粉紅和紫色分別來(lái)自天竺葵素和矮牽牛素的糖苷衍生物。20世紀(jì)90年代末，多名研究人員的生物化學(xué)分析結(jié)果表明：馬鈴薯塊莖皮和肉的紫色素在根本上是源于矮牽牛素[27-29]。有研究人員認(rèn)為，從分子結(jié)構(gòu)分析，矮牽牛素的生物合成應(yīng)該有2種可能：（1）由花青素（即矢車菊素）經(jīng)過甲氧基取代而成；（2）由飛燕草素（即花翠素、翠雀素）經(jīng)過甲基取代而成[18]。因此，矮牽牛素生物合成的前提是：花青素或飛燕草素的合成。花青素合成的關(guān)鍵酶是類黃酮-3′-羥化酶（F3′H），飛燕草素合成的關(guān)鍵酶是類黃酮-3′,5′-羥化酶（F3′5′H），所以，有研究人員認(rèn)為紫色馬鈴薯塊莖花色苷生物合成關(guān)鍵酶基因?yàn)椋侯慄S酮-3′-羥化酶基因和類黃酮-3′，5′-羥化酶基因。

2 國(guó)外馬鈴薯塊莖花色苷生物合成相關(guān)基因的研究現(xiàn)狀

2.1 研究理論和相關(guān)基因的分子標(biāo)記與功能

國(guó)外于花色素苷的合成代謝以及與之相關(guān)的基因研究開展地比較早，也比較深入。對(duì)花色苷生物合成的遺傳學(xué)研究起始于孟德爾的豌豆花色遺傳研究，早期是將基因位點(diǎn)與易于觀察的色彩變異聯(lián)系起來(lái)研究的。20世紀(jì)80年代末至90年代初，植物花色苷代謝途徑的研究已較為成熟，有些研究人員把影響花色苷代謝的基因分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因兩類，結(jié)構(gòu)基因直接編碼花色苷代謝生物合成的酶類，調(diào)節(jié)基因控制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)方式[30-31]。

花色素苷在發(fā)育過程中的合成主要通過合成的酶在量上的增加實(shí)現(xiàn)的，而這些合成酶量的增加則由于這些酶基因轉(zhuǎn)錄的增加所致，目前已發(fā)現(xiàn)不少調(diào)控花色苷生物合成途徑調(diào)控基因，并用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等方法克隆了部分基因[32-33]。

國(guó)外對(duì)馬鈴薯花色苷生物合成相關(guān)基因的研究以馬鈴薯的二倍體材料開始。認(rèn)為馬鈴薯花色苷的合成由3個(gè)基因控制：P控制著花和塊莖中花翠素的產(chǎn)生，R控制著塊莖中?；剀盏漠a(chǎn)生和花中花青素苷的產(chǎn)生，二者都決定花色苷的類型；Ac則控制著所有花色苷的?；?、葡萄糖殘基在苷元5位的連接和花翠素、花青素衍生物的甲基化[34-35]。但是，De Jong[22]認(rèn)為：①馬鈴薯二倍體和四倍體栽培種塊莖紅、紫、白的變異由R、P和I這3個(gè)獨(dú)立的基因座控制；②R和P分別負(fù)責(zé)馬鈴薯塊莖、花、芽和莖中紅、紫色花色苷色素的產(chǎn)生，而且P對(duì)于R具有上位性[34]，I卻是花色苷在塊莖皮中的組織專一性表達(dá)所必需的[34,36]；③基因型為I-Rr-Pp或 Ii-rr-P的塊莖具有紫皮，而基因型為I-R-pp具有紅皮；④在I缺乏功能等位基因的馬鈴薯產(chǎn)生白色塊莖[22]。R、P和I分別定位于第 2、11、10號(hào)染色體上[37-38]。此后，De Jong的觀點(diǎn)長(zhǎng)期統(tǒng)治馬鈴薯色素合成相關(guān)基因的研究。

2.2 花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因的克隆與功能

Jeon等[39]克隆到馬鈴薯查耳酮合酶基因（CHS）家族兩個(gè)成員的cDNA序列；De Jong等[23]以番茄DFR基因?yàn)樘结?，通過掃描由馬鈴薯的花和莖構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，克隆到二氫黃酮醇4-還原酶基因（DFR）全長(zhǎng)cDNA及其基因序列，進(jìn)一步進(jìn)行RFLP分析、PCR分析和共分離分析，驗(yàn)證了它的功能，他們認(rèn)為R編碼二氫黃酮醇-4-還原酶，一個(gè)DFR的等位基因關(guān)系到馬鈴薯產(chǎn)生紅色花色苷的能力。De Jong系統(tǒng)分析了R、P和I的具體功能：R是產(chǎn)生磚紅色天竺葵素類色素所必需的，似乎對(duì)應(yīng)二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）；P是產(chǎn)生紫色飛燕草素（即花翠素、翠雀素）類色素所必需的，似乎對(duì)應(yīng)類黃酮-3′5′-羥化酶（F3′5′H）；I是紅或紫色花色苷在塊莖皮中的組織專一性表達(dá)所必需的，似乎對(duì)應(yīng)于矮牽牛Myb型結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因（AN2）[24,40]。Jung等[41]以矮牽牛類黃酮-3′5′-羥化酶基因（F3′5′H）基因?yàn)樘结?，通過掃描馬鈴薯的花和莖構(gòu)建了cDNA文庫(kù)，獲得了馬鈴薯F3′5′H基因全長(zhǎng)cDNA及其基因序列。Keifenheim等[42]克隆到馬鈴薯無(wú)色花色素加雙氧酶基因（LDOX）和類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶基因（3GT）的cDNA序列。

花色苷生物合成調(diào)節(jié)基因的研究也取得了較多的成果，研究人員分別從玉米（Zea mays）、矮牽牛（Petunia hybride）、紫蘇（Perilla frutescens）克隆到an1，an2，an4，myb-p1等20多個(gè)調(diào)節(jié)基因，但是沒有涉及馬鈴薯研究成果的報(bào)道。

2.3 相關(guān)基因啟動(dòng)子的研究

國(guó)外對(duì)馬鈴薯花色苷生物合成相關(guān)基因啟動(dòng)子的研究首先從糖基轉(zhuǎn)移酶基因（GT）的開始。Rorat等[43]經(jīng)過 cDNA文庫(kù)差異篩選獲得馬鈴薯（S. sogarandinum）糖基轉(zhuǎn)移酶的啟動(dòng)子，而他這樣研究是因?yàn)樘腔D(zhuǎn)移酶與馬鈴薯抗低溫、紫外線等脅迫相關(guān)。Korobczak等[44]進(jìn)一步檢測(cè)了該啟動(dòng)子的環(huán)境因子誘導(dǎo)表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)它可被紫外線、低溫、光、鹽和脫落酸誘導(dǎo)，低溫與光、脫落酸與低溫對(duì)該啟動(dòng)子的誘導(dǎo)存在增效作用，而培養(yǎng)基中的蔗糖濃度高于2%時(shí)卻抑制該啟動(dòng)子活性,該啟動(dòng)子的細(xì)胞專一性主要體現(xiàn)為在葉片表皮和葉肉中高效表達(dá)，特別是在紫外線處理的情況下，它在莖組織中無(wú)活性，在塊莖中只在周皮內(nèi)的皮層中和維管束環(huán)中表達(dá)、在根中僅表達(dá)于根毛區(qū)[45]。

3 國(guó)內(nèi)對(duì)馬鈴薯花色苷生物合成相關(guān)基因的研究處于起步階段

2006年，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的Lu和Yang[25]通過簡(jiǎn)并引物從馬鈴薯野生種和栽培種中相繼完成馬鈴薯4個(gè)花色苷合成相關(guān)基因的cDNA克?。翰槎厦富?、黃烷酮3-羥化酶基因（F3H）、二氫黃酮醇4-還原酶基因和UDP-葡萄糖：類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶基因（3GT），并對(duì)其功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因在花、匍匐枝和頂芽中優(yōu)先表達(dá)，在根中僅UDP-葡萄糖：類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)，在塊莖皮中4個(gè)基因均被白光誘導(dǎo)表達(dá)。

4 研究展望

花色苷在本質(zhì)上屬于類黃酮，植物莖葉細(xì)胞中如果含有較多的花色苷，將會(huì)顯著提高其抵抗UVB輻射、低溫等不利環(huán)境條件的影響[45]。云貴高原是中國(guó)馬鈴薯的主產(chǎn)區(qū)之一，隨著全球環(huán)境惡化，大氣臭氧空洞的擴(kuò)大，地球特別是高海拔地區(qū)受到的紫外輻射越來(lái)越強(qiáng)，這勢(shì)必影響到高寒地區(qū)栽培的馬鈴薯等作物的生長(zhǎng)，因此培育花色苷含量高以適應(yīng)高寒冷涼地區(qū)生態(tài)環(huán)境的馬鈴薯新品種以保證云貴高原地區(qū)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展也有重要意義。

云南具有獨(dú)特的立體氣候，其氣候特征與馬鈴薯起源地-南美洲安第斯山區(qū)尤為相似，復(fù)雜氣候和生態(tài)條件使馬鈴薯分化出很多品系，在云南各地出現(xiàn)了許多彩色馬鈴薯地方品種，使云南的馬鈴薯種質(zhì)資源尤其豐富，如：蘭坪紫心、轉(zhuǎn)心烏、劍川紅、羅統(tǒng)紫芋、鐵廠紅、鶴慶紅等，為彩色馬鈴薯的研究利用提供了豐富的資源材料，這些農(nóng)家品種雖然具有許多缺點(diǎn)，但塊莖對(duì)光不敏感，不易變綠，塊莖內(nèi)不易形成對(duì)人體有害的龍葵素，耐貯藏且食味很好[4]。隨著社會(huì)發(fā)展和生活水平的提高，彩色馬鈴薯開始逐漸為人們所認(rèn)識(shí)，彩色馬鈴薯成為功能食品也會(huì)逐漸被人們所接受，培育彩色馬鈴薯新品種，也將成為發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的趨勢(shì)之一。

[1]屈冬玉,金黎萍,謝開云.大力發(fā)展冬季農(nóng)業(yè)夯實(shí)食物安全基礎(chǔ)[M]//陳伊里.馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與冬作農(nóng)業(yè).哈爾濱:哈爾濱工程大學(xué)出版社,2006:1-6.

[2]劉福翠,譚學(xué)林,郭華春.云南省馬鈴薯品種資源的RAPD分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2004,17(2)：200-204.

[3] Zhao C L,Guo H C,Liu F C,et al.Category and content of the tuber pigmentofSolanumtuberosumL.‘Zhuanxinwu’[J].ActaBotBoreal-Occident Sin,2007,27(10):1953-1961.

[4]楊瓊芬,白建明,楊萬(wàn)林,等.云南省彩色馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)和方向[J].中國(guó)馬鈴薯,2006,20(4):254-255.

[5] 何云昆,李先平,李樹蓮,等.云南省馬鈴薯的生產(chǎn)及品種評(píng)價(jià)[J].中國(guó)馬鈴薯,2000,14(2):122-124.

[6] 盧其能,楊清.馬鈴薯花色苷種類·含量和穩(wěn)定性初步研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(16):4811-4813.

[7] 唐傳核,彭志英.天然花色苷類色素的生理功能及應(yīng)用前景[J].冷飲與速凍食品工業(yè),2000(1):26-28.

[8] 趙福庚,何龍飛,羅慶云.植物逆境生理生態(tài)學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004:107-136.

[9] 蔣高明,常杰等.植物生理生態(tài)學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2004: 161-177.

[10] 謝慶華,李月秀,李智,等.特色馬鈴薯色素抗腫瘤活性[J].中國(guó)馬鈴薯,2004,18(4):213-214.

[11] 施明.類黃酮抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2001,28(2):96-99.

[12] 胡隆基.使用天然色素概述[J].全國(guó)食品添加劑通訊,1993(1):4-11.

[13] 張俊蓮,王蒂.我國(guó)馬鈴薯育種方式的變遷及其轉(zhuǎn)基因育種研究進(jìn)展[J].中國(guó)馬鈴薯,2005,19(3):163-167.

[14] 李燦輝,龍維彪,楊仕忠,等.馬鈴薯育種研究與云南馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展[J].云南農(nóng)業(yè)科技,2003（增刊）:95-101.

[15] 郭華春.云南薯類作物生產(chǎn)現(xiàn)狀與產(chǎn)業(yè)化前景分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2004,17（增刊）:384-387.

[16] 盛萬(wàn)民,王立春,李鳳云,等.馬鈴薯品質(zhì)性狀分子育種研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2005,2l(6):179-182.

[17] 戴朝曦,孫順娣,于品華,等.用生物技術(shù)培育馬鈴薯加工型品種的研究[M]//陳伊里.面向21世紀(jì)的中國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè).哈爾濱:哈爾濱工程大學(xué)出版社,2000:103-107.

[18] TanakaY,TsudaS,KusumiT.Metabolicengineeringtomodifyflower color[J].Plant Cell and Physiology,1998,39(11):1119-1126.

[19] 劉仕蕓,黃艷嵐,張樹珍.植物花青素生物合成中的調(diào)控基因[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(4):747-754.

[20] Holton T A,Edwina C C.Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis[J].The Plant Cell,1995,7:1071-1083.

[21] Brown C R,Wrolstad R,Durst R,et al.Breeding studies in potatoes containing high concentrations of anthocyanins[J].American Journal of Potato Research,2003,80:241-250.

[22] De Jong H.Inheritance of anthocyanin pigmentation in the cultivated potato:a critical review[J].American Journal of Potato Research,1991,68:585-593.

[23] De Jong W S,De Jong D M,De Jong H,et al.An allele of dihydroflavonol 4-reductase associated with the ability to produce red anthocyanin pigments in potato(Solanum tuberosum L.)[J]. Theoretical and Applied Genetics,2003,107:1375-1383.

[24] De Jong W S,Eannetta N T,De Jong D M,et al.Candidate gene analysis of anthocyanin pigmentation loci in the Solanaceae[J]. Theoretical and Applied Genetics,2004,108:423-432

[25] Lu Q N,Yang Q.cDNA cloning and expression of anthocyanin biosynthetic genes in wild potato(Solanum pinnatisectum)[J].African Journal of Biotechnology,2006,5(10):811-818.

[26] Howard H W,Kukimura H,Whitmore E T.The anthocyanin pigments of the tubers and sprouts of Tuberosum potatoes[J].Potato Research,1970,13(2):142-145.

[27] LewisCE,WalkerJRL,LancasterJE,etal.Determinationofanthocyanins,flavonoids and phenolic acids in potatoes.I.Coloured cultivars of Solanum tuberosum L.[J].Journal of the Science of Food andAgriculture,1998,77:45-57.

[28] Naito K,Umemura Y,Mori M,et al.Acylated pelargonidin glycosides from a red potato[J].Phytochemistry,1998,47:109-112.

[29] Rodriguez-Saona L E,Giusti M M,Wrolstad R E.Anthocyanin pigment composition of red-fleshed potatoes[J].Journal of Food Science,1998,63:458-465.

[30] 陳麗.植物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能[J].植物生理學(xué)通訊,1997, 33(6)：40l-409.

[31]葛靜,嚴(yán)海燕.花色苷形成中的基因表達(dá)與調(diào)控[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(2):374-380.

[32] FukadaTS,InagakiY,YamaguchiT,etal.Colour-enhancingprotein in blue petals[J].Nature,2000,407:581.

[33]包滿珠.植物花青素基因的克隆及應(yīng)用[J].園藝學(xué)報(bào),1997,24(3): 279-284.

[34] DoddsKS,LongDH.Theinheritanceofcolour in diploid potatoes.I. Types of anthocyanidins and their genetic loci[J].J Genet,1955,53: 136-149.

[35] Harborne J B.Plant polyphenols 1.Anthocyanin production in the cultivated potato[J].Biochemical J,1960,74:262-269.

[36] Dodds K S,Long D H.The inheritance of colour in diploid potatoes. II.A three-factor linkage group[J].J Genet,1956,54:27-41.

[37] Van Eck H J,Jacobs J M E,van Dijk J,et al.Identification and mapping of three flower colour loci of potato(S.tuberosum L.)by RFLPanalysis[J].TheorApplGenet,1993,86:295-300.

[38] Van Eck H J,Jacobs J M E,Van Den Berg P M M M,et al.The inheritance of anthocyanin pigmentation in potato(Solanum tuberosum L.)and mapping of tuber skin colour loci using RFLPs[J]. Heredity,1994,73:410-421.

[39] Jeon J H,Joung H,Byun S M.Characterization of two members of the Chalcone Synthase gene family from Solanum tuberosum L.[J]. Plant Physiol,1996,111:348-348.

[40] Quattrocchio F,Wing J F,van der Woude K,et al.Molecular analysis of the anthocyanin gene of petunia and its role in the evolution of flower color[J].Plant Cell,1999,11:1433-1444.

[41] Jung C S,Griffiths H M,De Jong D M,et al.The potato plocus codes for flavonoid 3',5'-hydroxylase[J].Theor Appl Genet, 2005,110:269-275.

[42] Keifenheim D L,Smith A G,Tong C B S.Cloning and accumulation of anthocyanin biosynthesis genes in developing tubers[J].American Journal of Potato Research,2006,83(3):233-239.

[43]Rorat T,Grygorowicz W J,Berbezy P,et al.Isolation and expression of cold specific genes in potato(Solanum sogarandinum)[J].Plant Sci,1998,133:57-67.

[44] Korobczak A,Aksamit A,Lukaszewicz M,et al.The potato glucosyltransferase gene promoter is environmentally regulated[J].Plant Science,2005,168:339-348.

[45] Leng P,Qi J X.Effect of anthocyanin on David peach(Prunus davidianaFranch)underlowtemperature[J].Scientia Horticulturae, 2003,97:27-39.