錢衛(wèi)東，王婷

1(陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安，710021)

2(河南科技大學動物科技學院，河南洛陽，471003)

影響暗發(fā)酵制氫因素的研究進展*

錢衛(wèi)東1，王婷2

1(陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安，710021)

2(河南科技大學動物科技學院，河南洛陽，471003)

暗發(fā)酵制氫具有產氫能力高、速率快、持續(xù)穩(wěn)定、原料來源廣泛且成本低等特點，易于實現規(guī)模化生產，已成為制氫領域的研究熱點。文中主要介紹了對暗發(fā)酵制氫高效、持續(xù)和穩(wěn)定產氫有重要影響的影響因子，如接種物、pH值、溫度以及水力停留時間(hydraulic retention time，HRT)。概述了暗發(fā)酵制氫技術近年來的研究現狀和其發(fā)展趨勢。

生物制氫技術，暗發(fā)酵，影響因素

氫被公認為是最有發(fā)展前景的可再生清潔能源之一，是一種最具發(fā)展?jié)摿Φ幕剂咸娲茉碵1］。暗發(fā)酵生物制氫是利用厭氧發(fā)酵產氫細菌在厭氧條件下將有機物分解轉化為氫氣。此過程不需要光能供應，能將產氫與有機物的去除有機地耦合在一起，而且能夠進行暗發(fā)酵產氫的微生物種類繁多。暗發(fā)酵制氫是一個非常復雜的過程易受多種因素影響，如接種物、溫度、pH值和水力停留時間(hydraulic retention time，HRT)等。對這些因素，研究人員已經進行了大量相關研究。本文試圖對前人的研究進展進行簡要的總結，為今后的暗發(fā)酵生物制氫研究工作提供科學依據及建議。

1 接種物

暗發(fā)酵產氫微生物主要是指一些在無光照條件下通過分解有機物來獲得放氫能量的微生物。這些微生物廣泛存在于土壤、污泥、沼澤、熱泉甚至動物胃中，可以分解有機物放出氫氣。因此，在混合培養(yǎng)系統(tǒng)中，用于產氫的接種物來源廣泛。到目前為止，用于發(fā)酵制氫的混合菌群主要來源于厭氧消化污泥、活性污泥、好氧堆肥、土壤、湖泊沉積物、海洋潮汐污泥等自然環(huán)境中[2］。能夠進行暗發(fā)酵產氫的微生物種類繁多，包括一些專性厭氧細菌、兼性厭氧細菌及少量好氧細菌，例如放氫梭菌屬(Clostridium)、埃希氏腸桿菌屬(Enterobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)等。其中，在厭氧混合發(fā)酵制氫過程中，產生的氫氣很容易被耗氫菌如甲烷菌屬(Methanogenus)、同型乙酸菌屬(Homoacetogenic bacteria)和丙酸菌屬(Propionibacterium Orla-Jensen)等細菌消耗[3］。因此，為了提高產氫菌產氫氣產量，接種物必須經過預處理來抑制耗氫菌的生物活性，同時要保持產氫菌的制氫能力。目前對從天然接種物中富集產氫菌群進行預處理的方法主要包括以下幾種:熱、酸、堿、暴氧、凍融、氯仿、2-溴乙烷磺酸鈉(2-bromoethanesulfonate，BESA)、碘丙烷等處理方法。

熱處理接種物已經被廣泛用于暗發(fā)酵制氫的啟動過程[4］。熱處理的溫度一般在60～120°C，處理時間為15～300 min[5-7］。接種物在經過熱處理之后，許多產氫菌能形成芽孢，如放氫梭菌屬、芽孢桿菌屬和熱解糖梭菌(Thermoanaero bacterium)[8］，而不能形成芽孢的甲烷菌則被殺死，從而使產氫菌得到富集。雖然熱處理被廣泛用于富集產氫菌群并且顯著提高了氫氣產量，然而值得注意的是，該方法也具有局限性。一方面，雖然熱處理能完全殺死甲烷菌，但是同時也降低了接種物中的微生物多樣性，其中許多不能產生芽孢的產氫菌也同樣被殺死，如埃希氏腸桿菌屬和枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)[9］，這直接導致產氫效率降低[10］。另一方面，由于某些同型乙酸菌在熱應激時也能形成芽孢[11］，因此熱處理并不能抑制此類菌的耗氫活性，其中存活下來的同型乙酸菌繼續(xù)利用氫氣生成乙酸，這導致氫氣產量的總體出現下降。值得注意的是，熱處理獲得的產氫細菌菌群的延遲時間一般較長。

一些產氫菌可以在較寬pH范圍內生長，而耗氫菌中比例較大的甲烷菌對pH的變化敏感，在極端pH條件下就會死亡。因此，酸堿處理接種物能有效地抑制甲烷菌的生物活性和提高氫氣產量。Chen等[12］研究發(fā)現，經酸和堿分別處理后的污泥，氫氣產量相應地提高了333和200倍。此外，Cheong和Hansen也研究發(fā)現，經酸處理后的污泥的氫氣產量顯著提高[13］。但是，也有報道表明，經堿處理后的接種物并不能完全抑制甲烷菌生物活性，而且酸或堿處理還影響氫氣生產[14-15］。出現上述不同的結果，其原因可能由于底物或者培養(yǎng)條件不同所致，這需要對實驗條件進行綜合權衡。

接種物中所占比例較大的嚴格厭氧的產甲烷菌對氧氣和許多化學品非常敏感如氯仿和BESA，因此可以通過暴氧或者添加這些有毒的化學抑制劑來抑制該菌的耗氫活性。雖然經過曝氣處理的接種物可以顯著提高氫氣產量[16］，但是這種方法并不能完全抑制甲烷菌的生物活性[11］。氯仿、BESA、碘丙烷和乙炔等化學抑制劑能高效地抑制甲烷菌的生物活性。其中氯仿能抑制甲烷菌利用H2/CO2或者乙酸來生產甲烷[17］，低濃度的氯仿(100 μm)便能強烈抑制甲烷菌的生物活性。Hu等[18］研究表明，0.05%的氯仿不但完全抑制了甲烷菌的生物活性，而且還顯著提高了氫氣產量，其原因可能是由于氯仿也能抑制同型乙酸菌的部分生物活性。值得關注的是，高濃度的氯仿會抑制產氫菌的部分生物活性，從而負面地影響了氫氣產量。BESA是甲烷菌輔酶M的類似物，其中甲烷菌輔酶M只存在于細胞內，因此BESA可以專一的抑制產甲烷菌的活性。25 mmol/L的BESA就能顯著地抑制甲烷菌的生物活性，并能非常有效地提高氫氣產量[19］。但是，低劑量BESA(10 mmol/L)對氫氣產量提高沒有顯著影響，可能是由于劑量太低造成的[18］。碘丙烷是類咕啉拮抗劑，它能抑制維生素B12輔酶功能，雖然它可以抑制甲烷菌的活性，但是對氫氣產量影響較小，如經碘丙烷處理后其產氫能力為5.64 mol/mol(蔗糖)，而對照組的產氫量為5.17 mol/mol(蔗糖)[18］。需要注意的是，為實現氫氣的工業(yè)化生產，通過使用化學抑制劑抑制耗氫菌的生物活性在經濟上是不可行的，這意味著實驗室階段使用的BESA或者碘丙烷的甲烷菌抑制劑并不能用于大規(guī)模氫氣的生產。

2 pH值

在暗發(fā)酵制氫中，pH值通過干擾細胞內NADH/NAD動態(tài)平衡和產氫菌的生理條件而影響發(fā)酵產氫的效率。pH會影響氫化酶的活性，并且還影響產氫菌細胞的氧化還原電位、代謝產物及其形態(tài)等方面。因此，正確控制反應體系中的pH是影響產氫菌產氫的一個關鍵因素。此外，pH還影響耗氫細菌如丙酸菌和甲烷菌的生物活性[20］。但是迄今為止，研究人員對于暗發(fā)酵制氫的最佳pH值范圍，分歧很大尚未達成一致的結論，其原因可能是由于實驗所用的底物、接種物或者培養(yǎng)條件的不同造成的。一般認為，暗發(fā)酵產氫的最佳pH值范圍在pH 5.0～6.0[21-23］。也有許多研究發(fā)現，產氫的最佳 pH在6.0～8.0[24-26］。而且還有其他報道的最佳 pH 值，其中任南琪教授研究組在研究糖漿廢水發(fā)酵產氫時，發(fā)現產氫的最佳 pH 值在4.2～4.5 左右[27-29］。Cai等研究發(fā)現、堿處理后的污泥自身發(fā)酵產氫的最佳pH為11.0[30］。但是，大部分研究結果表明，盡管發(fā)酵起始pH不同，但發(fā)酵結束后的終pH值一般都在4.0～6.0[31-32］，這主要是由于揮發(fā)性脂肪酸的快速大量產生從而削弱了發(fā)酵液的緩沖能力造成的。特別值得注意的是，pH值的逐漸下降影響了氫化酶的生物活性，從而抑制了氫氣生產，因此，發(fā)酵過程中的pH值必須控制在最佳水平。此外，初始pH值不但影響氫氣生產，還影響了產氫延遲時間。研究發(fā)現，當初始pH為4.0～4.5時，產氫延遲時間很長，最高可長達20h[33］。值得注意的是，盡管利用高的初始pH縮短了產氫延遲時間，但是氫氣產量也受到不利影響。除此以外，由于最佳初始pH值不能反映發(fā)酵過程中的pH值實際變化，所以最佳初始pH值只是具有參考價值，因此，在發(fā)酵制氫過程中也需要控制pH值。

3 溫度

溫度不僅可以加快微生物細胞代謝，而且可以促進氫氣從培養(yǎng)液中釋放利于細菌進一步產氫，因此溫度是影響產氫微生物活性及其氫氣生產的重要因素之一[34-35］。大部分產氫微生物屬于嗜溫菌，厭氧菌的最適生長溫度在嗜溫菌生長溫度范圍的上限，但不同發(fā)酵產氫微生物的產氫溫度也存在較大的差異。目前報道的暗發(fā)酵制氫的溫度范圍主要包括中溫(25～40℃)、高溫(40～65℃)、極端高溫(65～80℃)及超高溫(大于80℃)[36］。值得注意的是暗發(fā)酵制氫的反應溫度通常在中溫和高溫條件下進行。在中溫條件下，Lay等[4］通過批次試驗研究市政有機固體廢棄物發(fā)酵，表明氫氣產量達50 mL H2/g-VS。同樣，Okamoto等[37］通過批次發(fā)酵研究HSW如稻米和胡蘿卜產氫特點，表明氫氣產量在19.3～96.0 mL/g-VS。Valdez-Vazquez等[38］使用連續(xù)流攪拌槽式反應器(continuous stirred tank reactor，CSTR)研究市政固體廢棄物發(fā)酵特點，發(fā)現氫氣產量為95.14 mL/g-VS。Wang等[34］利用含有葡萄糖的廢水作為底物發(fā)現，當發(fā)酵溫度為40℃時，氫氣產量最大，可達到275.1 mL/g-glucose。此外，高溫發(fā)酵制氫比中溫發(fā)酵更有利于提高氫氣產量和氫氣產生速率。Yu等[39］研究發(fā)現，在高溫條件下，高強度稻米釀酒廠廢水連續(xù)發(fā)酵制氫的氫氣產量明顯高于中溫和低溫時的氫氣產量。Morimoto等[32］研究發(fā)現，葡萄糖發(fā)酵時的最高氫氣產量出現在55℃。Valdez-Vazquez等[38］通過半連續(xù)產氫試驗詳細比較了市政固體廢棄物有機組分中溫和高溫發(fā)酵的產氫特點，表明高溫發(fā)酵時的氫氣含量(58%)顯著高于中溫時的氫氣含量(42%)，并且氫氣產量也顯著優(yōu)于中溫發(fā)酵。其中中溫發(fā)酵的氫氣產量只有理論氫氣產量的37%，而高溫發(fā)酵的氫氣產量則高達83%。Cheong等[40］利用批次試驗證明葡萄糖發(fā)酵產氫高溫時的氫氣產量也明顯高于中溫時的產量。然而，通過實驗一些研究人員發(fā)現極端高溫時的氫氣生產比中溫和高溫發(fā)酵產氫更有利[41］。據報道，在極端高溫條件下(70℃)，氫氣產量達到了4 mol/mol-glucose，而在中溫和高溫條件下的氫氣產量只有2 mol/mol-glucose左右[42］，因此尚未看出常溫發(fā)酵制氫的優(yōu)勢。其主要機制在于極端高溫發(fā)酵可以有效的殺死病原菌，減少甲烷菌等耗氫細菌的污染。需要指出的是，從節(jié)能的角度考慮采用高溫發(fā)酵耗能巨大，這可能限制了該技術在實際工程中的應用。

4 水力停留時間

對于利用器連續(xù)流攪拌槽式反應器(continuous stirred tank reactor，CSTR)進行生物制氫，HRT 是連續(xù)產氫過程中的一個重要調控因子?？s短HRT可以降低耗氫菌對氫氣產生的不利影響，減小反應器體積和降低成本[43］。從目前的研究看，厭氧反應器控制的水力停留時間通常取決于產氫原料(底物)，并且水力停留時間的差異與反應器結構形式的差異密切相關。目前進行得理論研究主要使用純底物(如葡萄糖、蔗糖、淀粉和纖維素等)，而生產性應用通常為非常復雜的底物。研究發(fā)現，在CSTR中運行蔗糖發(fā)酵，最佳的HRT一般在8～12 h[43］。然而，淀粉發(fā)酵的最佳HRT一般在12.7～20.2 h[44］，纖維素發(fā)酵的HRT則延長到3 d[45］。表明隨著底物復雜程度的上升，HRT也相應延長[46］。在連續(xù)產氫發(fā)酵過程中，pH和HRT是一個相互偶聯(lián)的過程參數。在中溫和高溫發(fā)酵條件下，這兩個參數的最優(yōu)組合可以有效的分開產氫菌和耗氫菌。Fang和Liu[21］在葡萄糖連續(xù)產氫的過程中發(fā)現，在HRT為6 h和pH6.0時，仍有甲烷的產生，他們推測甲烷菌可能吸附在了CSTR的內壁上。然而，Lin等[47］在 pH6.8和 HRT2～12h的條件下運行CSTR發(fā)酵蔗糖超過350 d，并沒有檢測到甲烷菌。Fan等[48］在CSTR中利用熱處理牛糞堆肥作為接種物發(fā)酵啤酒廠廢棄物，在pH6.5和HRT 18h的條件下連續(xù)產氫10個月，也沒有檢測到甲烷。雖然縮短HRT可以有效的去除甲烷菌，但是它仍然不能阻止其它耗氫菌對產氫的不利影響如同型乙酸菌、丙酸菌和乳酸菌。研究發(fā)現，同型產乙酸作用、丙酸生產和乳酸生產主要出現在pH 5.0以上[49］。因此，維持系統(tǒng)的較低的pH將更有利于氫氣的生產和提高氫氣產量[21］。Khanal等[50］利用連續(xù)批次反應器研究蔗糖發(fā)酵產氫表明，pH從5.2降低到4.8更有力于提高氫氣產量。任南琪教授等[51］在研究糖漿廢水連續(xù)產氫過程中，發(fā)現pH 4.0～4.5和HRT 4～6h為乙醇型發(fā)酵的最佳條件在pH4.9時，沒有氫氣產生。

5 展望

由于人類對能源需求日益增長，致使賴以依存的化石能源將日益枯竭，亟需尋求可再生、高效、清潔能源來替代，而氫氣正是目前最理想的清潔燃料之一。因此，氫氣必將成為后化石燃料時代的能源主要供應方式之一。目前，無論從環(huán)境保護，還是資源可持續(xù)發(fā)展的角度來看，暗發(fā)酵法生物制氫技術具有很大的發(fā)展?jié)摿?。但是，到目前為止，暗發(fā)酵制氫工業(yè)化進程仍處于起步階段，其在若干研究領域尚需進行更深一步的研究。

5.1 接種物的選擇

雖然接種物來源的廣泛性，但是接種物性質上的不同，很大程度的影響了產氫發(fā)酵過程。因此為了提高氫氣產來能夠，針對特定的底物必須選擇合適的接種物。雖然熱處理已被證明是一個非常有效的從厭氧消化污泥中富集產氫菌群的方法，但是它只能富集能形成芽孢的產氫菌，其中一些產氫能力可能較強但不能形成芽孢的產氫菌則被殺死。

5.2 過程參數系統(tǒng)集成分析

其次，系統(tǒng)地研究關鍵過程參數對氫氣生產的影響。到目前為止，文獻中報道的結果大部分都是來自于某些培養(yǎng)條件下數據如溫度和pH，為數據比較與分析帶來了相當大的困難，這需要對系統(tǒng)關鍵過程參數進行綜合統(tǒng)籌，從整體水平上系統(tǒng)地研究各種參數。

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ABSTRACTBiohydrogen production through dark fermentation has been a research focus，due to its high-capacity and high-speed of biohydrogen production，its sustainability and stability，simple operation of its reaction device and a wide range of low-cost renewable raw materials.In this paper，influencing factors including inoculum，temperature，pH and hydraulic retention time which are important to high efficient，continuous and stable hydrogen production by dark fermentation are summarized and the progress of biohydrogen production is introduced.

Key wordsbiohydrogen production technology，dark-fermentation，influencing factor

Progress on Investigation of Influencing Factors for Bio-hydrogen Production Through Dark-fermentation

Qian Wei-dong1，Wang Ting2
1(School of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China)
2(Animal Science and Technology School，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China)

博士，講師。

*國家自然科學基金(31100040)，陜西省教育廳專項科研計劃項目(11JK0624)，陜西科技大學博士科研啟動基金(BJ10-15)

2012-01-11，改回日期:2010-02-23