董軍磊，歐 元，李彩霞，徐建棟，葉 健

（1.中國(guó)人民公安大學(xué)，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038；3.北京理工大學(xué)，北京 100081）

1 引言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction, PCR)是1985 年美國(guó) Cetus 公司的 Mullis等人發(fā)明的一種具有里程碑意義的新技術(shù)，使得核酸的體外無(wú)限擴(kuò)增成為現(xiàn)實(shí)。隨著第一臺(tái)PCR熱循環(huán)儀的問(wèn)世，PCR技術(shù)作為一種重要的手段，被廣泛地應(yīng)用到分子生物學(xué)和基因工程實(shí)驗(yàn)室、疾病檢測(cè)、臨床應(yīng)用、商品檢疫、法醫(yī)鑒定、新藥開(kāi)發(fā)和工農(nóng)業(yè)制品的開(kāi)發(fā)等方面[1]。

得益于陣列毛細(xì)管電泳等先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，人類基因組計(jì)劃提前完成，這讓人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到檢測(cè)工具的重要性。隨著后基因時(shí)代的到來(lái)，待檢測(cè)樣本量日益增大，這需要對(duì)大量樣本進(jìn)行快速PCR，同時(shí)新的分析方法和檢測(cè)技術(shù)也推動(dòng)檢測(cè)儀器向微型化、自動(dòng)化、快速化、集成化、便攜化發(fā)展。1990年，Manz和Widmer把當(dāng)時(shí)微電子領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)展成熟的微電機(jī)加工技術(shù)(micro-electronic mechanical system，MEMS)作為加工平臺(tái)來(lái)實(shí)現(xiàn)全部分析功能在芯片上的微型化，首次提出了微全分析系統(tǒng)（Micro Total Analysis System，μ-TAS ）的概念[2]，在此后的二十幾年中發(fā)展成為世界上最前沿的科技領(lǐng)域之一。目前其核心技術(shù)即是以微流控技術(shù)（Microfluidics）為基礎(chǔ)的微流控芯片。微流控PCR芯片是一種典型的用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)的微流控芯片，它采用先進(jìn)的MEMS技術(shù)，最大限度地將生化分析的操作步驟集成到芯片上，與常規(guī)熱循環(huán)儀相比，具有微型化、消耗試劑少，升降溫速度快、易于與其他裝置集成等特點(diǎn)，成為芯片研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

2 微流控PCR芯片研究進(jìn)展

2.1 制作材料

用于制作PCR芯片的材料主要有單晶硅、石英和玻璃、高分子聚合材料, 如光膠SU-8、聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane, PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate,PMMA)等。單晶硅是最早適用的芯片基材，加工工藝及相關(guān)設(shè)備完善，但硅材料易碎、價(jià)格貴、抗腐蝕性能不夠好, 且對(duì)PCR反應(yīng)抑制作用[3]。玻璃和石英有著很好的抗腐蝕性，且廉價(jià)易得。由于其制作工藝復(fù)雜，在一定程度上影響了其應(yīng)用。聚合物材料品種多，價(jià)廉，無(wú)毒、易于大批量生產(chǎn)。其中PDMS是目前最常用的聚合物材料，因?yàn)樗鼉r(jià)格便宜，加工工藝簡(jiǎn)單，又有很好生物相容性和熱穩(wěn)定性。

2.2 制作方法

PCR芯片的制造，與多數(shù)微流控芯片一樣，依據(jù)材料的不同有著不同的制作工藝。對(duì)于硅、玻璃等材料為主的微流控芯片主要采用光刻和蝕刻技術(shù)進(jìn)行加工, 通過(guò)光刻和蝕刻技術(shù)可以在基底材料上獲得各種形狀和大小的微管道。使用LIGA(Lithographie、Galvanoformung、Abformung) 技術(shù)可以達(dá)到高分辨率刻蝕，但對(duì)設(shè)備和環(huán)境要求也非常高。聚合物芯片上的微結(jié)構(gòu)一般采用模塑法、注塑法、熱壓法、軟光刻(soft lithography)、激光燒蝕法、LIGA技術(shù)等方法[4]制成。

2.3 加熱方式

微流控PCR芯片的加熱方式一般根據(jù)加熱源與微反應(yīng)室的相對(duì)位置分為接觸式加熱和非接觸式加熱。

2.3.1 接觸式加熱

現(xiàn)有微流控PCR芯片多數(shù)都采用接觸式加熱方式，主要有分體式和集成式兩種。分體式加熱方式最簡(jiǎn)單的就是采用導(dǎo)熱性好的銅塊[5-7]或鋁塊[8-9]。另外一種常用的是采用珀耳帖（Peltier）半導(dǎo)體加熱制冷片[8,10]，其上面為熱面，下面為冷面，通過(guò)改變電流方向來(lái)使冷熱面互換，溫差可達(dá)60℃。還有報(bào)道通過(guò)化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行加熱和冷卻[11]。分體式加熱往往是外置的，加工簡(jiǎn)單，成本小，但熱容較大，加熱和冷卻速度慢，不易于集成微型化。

相對(duì)于分體式加熱方式，集成式加熱方式是利用沉積、濺射等微加工技術(shù)直接將加熱原件和測(cè)溫原件集成在微流控芯片上，熱容小，耗能低，集成化程度高。主要采用金屬薄膜加工工藝，最常用的金屬是鉑（Pt），一般現(xiàn)在微反應(yīng)室底部沉積一層鈦或鉻，實(shí)現(xiàn)金屬鉑與硅或玻璃的良好接觸。也有用鋁[12]、銀[13]和鎢[14]加熱。氧化銦錫（ITO）[15-16]具有良好的透光性，也常被濺射到玻璃基片上，通過(guò)光刻技術(shù)形成加熱器和溫度傳感器。

2.3.2 非接觸式加熱

采用非接觸式熱循環(huán)系統(tǒng)可提高熱交換效率，不影響芯片加工。常用的非接觸熱源有紅外線[17-18,37,46]、熱空氣[19]、激光[20]、微波[23]等。

2.4 微流控PCR芯片的分類

目前，根據(jù)熱循環(huán)方式的不同，微流控PCR芯片主要分為靜態(tài)腔室PCR芯片（Static chamber PCR）和連續(xù)流PCR芯片（Continuous-flow or flow-through PCR）兩種模式。

2.4.1 靜態(tài)腔室PCR芯片

靜態(tài)腔室PCR芯片與傳統(tǒng)PCR儀的工作原理類似，通過(guò)加熱裝置動(dòng)態(tài)的溫度變化，促使微室腔內(nèi)的混合試樣完成聚合酶鏈反應(yīng)；由于腔室的體積小至幾微升，因此熱容非常小，可以實(shí)現(xiàn)快速加熱和制冷，并且有利于實(shí)現(xiàn)多功能集成和制造。自從1993年Northrup[21]等采用MEMS技術(shù)首次在硅微流控芯片上成功實(shí)現(xiàn)靜態(tài)PCR擴(kuò)增以來(lái)，許多研究者從事靜態(tài)腔室PCR芯片的研究工作，由于這種方法熱循環(huán)次數(shù)不受限制，可以根據(jù)不同需要設(shè)計(jì)不同類型的腔室。

Poser等[22]在硅片上加工了2到10個(gè)微升級(jí)（5-10μl）的PCR芯片，并用淀積的方法在微芯片上集成微加熱片和溫度傳感器作為微控溫系統(tǒng)。升溫速度為80℃/s，降溫速度為40℃/s，溫度變化可精確控制在0.1℃/s。Oh等[23]在玻璃上制作了4個(gè)約0.95μl的多微反應(yīng)腔芯片。Shaw等[24]在玻璃制作了含有0.7μl微反應(yīng)腔室的微流控PCR芯片，采用非接觸式微波作為加熱源,結(jié)合冷空氣降溫，熱循環(huán)的升降溫速率達(dá)65℃/s，溫控偏差±0.5℃。Sundberg[25]等在塑料光盤制作1000個(gè)納升級(jí)的微孔內(nèi)，孔的容積為33μl，用離心法進(jìn)行樣品分裝，用快速空氣加熱和實(shí)時(shí)熒光進(jìn)行檢測(cè)。完成循環(huán)用時(shí)33s，擴(kuò)增效率達(dá)94%；300bp的質(zhì)粒DNA樣品在58-1000個(gè)孔內(nèi)完成擴(kuò)增和分析用時(shí)在50min以內(nèi)，證明這種簡(jiǎn)易的圓盤PCR裝置可以減少一次性品消耗和熱循環(huán)時(shí)間。

2.4.2 連續(xù)流PCR芯片

1998年，Kopp[26]等首次報(bào)道了一種樣品可在不同溫度的恒溫區(qū)間內(nèi)連續(xù)流動(dòng)的PCR芯片，三個(gè)溫度區(qū)(95℃、77℃和60℃)由三個(gè)恒溫銅塊來(lái)實(shí)現(xiàn)，由驅(qū)動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)PCR反應(yīng)試樣沿微通道順序流經(jīng)這三個(gè)溫度區(qū)，并精確控制流速。在流動(dòng)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)變性、退火、延伸反應(yīng)，完成擴(kuò)增。這種連續(xù)流PCR不像靜態(tài)腔PCR那樣依賴溫度隨時(shí)間的變化，而是靠流過(guò)不同的恒溫區(qū)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。PCR的擴(kuò)增效率取決于混合試樣在某一溫區(qū)停留的實(shí)踐，即該溫區(qū)相應(yīng)微通道的長(zhǎng)度、通道截面積及混合試樣的流速。由于連續(xù)流PCR芯片主要依靠流路微通道實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，具有熱傳遞和熱循環(huán)速度快的優(yōu)點(diǎn)。但這中逶迤式連續(xù)流PCR芯片的循環(huán)次數(shù)是固定的，不便于靈活控制。

2003年Obeid 等[5]研制了一種連續(xù)流微流控型PCR 芯片，使其不僅能夠?qū)崿F(xiàn) DNA 的擴(kuò)增，還可以在芯片中完成 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，進(jìn)而能夠用于RNA 的逆轉(zhuǎn)錄 PCR 過(guò)程；同時(shí)，在該設(shè)計(jì)中，芯片的微通道在不同位置處開(kāi)設(shè)出口，使得該芯片PCR循環(huán)次數(shù)能夠在20、25、30、35、40之間選擇。該設(shè)計(jì)方案極大地提高了微流控型 PCR 芯片的應(yīng)用范圍，使其不必拘泥于過(guò)于死板的循環(huán)次數(shù)的限制。Chiou等[27]、Frey等[6]分別報(bào)道了一種往復(fù)式通道，通過(guò)對(duì)流體的雙向驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，控制混合試樣在不同恒溫區(qū)之間來(lái)回反復(fù)流動(dòng)而實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增，這樣既減少了通道長(zhǎng)度，節(jié)省了空間，又控制了循環(huán)次數(shù)。

連續(xù)流PCR芯片在驅(qū)動(dòng)力方面，很多研究者[28-31]報(bào)道一種使用不同溫區(qū)下的溫差所產(chǎn)生的對(duì)流浮力（Buoyancy force）進(jìn)行管內(nèi)反應(yīng)液驅(qū)動(dòng)的方法，并利用此原理制作出了快速，便攜的微流控PCR擴(kuò)增裝置，成功進(jìn)行了DNA的擴(kuò)增。但是對(duì)流浮力驅(qū)動(dòng)的芯片，對(duì)擺放位置要求較高[1]，且擴(kuò)增效率有待進(jìn)一步研究[29]。

對(duì)于上述類型連續(xù)流PCR芯片，微通道中只有單相的反應(yīng)混合液流動(dòng)，連續(xù)進(jìn)行多種樣本擴(kuò)增時(shí)將會(huì)造成樣本相互污染、管壁吸附、蒸發(fā)和擴(kuò)散稀釋[32]。劉金華[33]設(shè)計(jì)一種螺旋式連續(xù)流PCR芯片實(shí)現(xiàn)了樣品間無(wú)交叉污染，但仍需進(jìn)行微通道洗滌。近年來(lái)，基于液滴微流體技術(shù)的液滴型微 PCR 芯片克服了這些不足。Wang等[34]首先報(bào)道了這種液滴型PCR芯片裝置，該裝置用注射泵驅(qū)動(dòng)PCR反應(yīng)液滴在95℃、72℃、55℃三個(gè)溫區(qū)間往復(fù)運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。Bu等[35]采用數(shù)值模擬研究了芯片熱循環(huán)性能和壓電泵的驅(qū)動(dòng)特性，結(jié)果表明基于液滴的微PCR芯片具有非常好的升降溫性能。Wang等[32]對(duì)液滴微流控PCR芯片的發(fā)展和優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)，展示了一種納米級(jí)液滴微流控PCR芯片，研究了反應(yīng)液濃度、在一溫區(qū)停留時(shí)間和模版量對(duì)液滴PCR的影響，提供了這種液滴微流控系統(tǒng)的詳細(xì)信息和在優(yōu)化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)了操作方面的參數(shù)。

3 微流控PCR芯片在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中的應(yīng)用及展望

3.1 DNA定量

DNA定量在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中是必要的步驟，其主要目的確定要擴(kuò)增的DNA的量。DNA混有抑制劑或高度降解或量太少都可導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗。因此，這就需要精確地測(cè)驗(yàn)DNA模板的數(shù)量和質(zhì)量，定量必須只針對(duì)人類DNA且要靈敏[36]。在芯片上直接進(jìn)行法醫(yī)DNA定量需要用實(shí)時(shí)PCR(real time PCR,RT-PCR)或定量PCR(quantitative PCR, qPCR)。

Horsman等[36]綜述了利用微流控PCR芯片進(jìn)行DNA定量檢測(cè)的幾種方法，分別是Taqman熒光探針?lè)ǎ∟orthrup等，1998；Liu等，2002）、SYBR熒光染料法（Lin等，2002）和電化學(xué)方法（Lee等，2003）。他指出這些方法雖然對(duì)DNA定量是有效的，但都集成了加熱器和溫感器等，做成一次性適用的芯片成本比較大，而一次性適用在法醫(yī)檢驗(yàn)中是很重要的。

2011年Yu[37]等展示了一種用于DNA定量的微流控裝置。采用外置的紅外線加熱方法和SYBR熒光染料，結(jié)合適當(dāng)?shù)臑V鏡，把紅外線對(duì)熒光背景的影響降到最低，使整個(gè)熱循環(huán)過(guò)程中產(chǎn)生的熒光信號(hào)都被檢測(cè)到，成功對(duì)實(shí)現(xiàn)DNA的定量。這種裝置采用非接觸式紅外加熱，降低了芯片的制作成本，便于芯片的一次性適用，也有利與和PCR前的樣本提取、純化及PCR后的電泳檢測(cè)集成。

要利用微流控技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確有效的DNA定量，還有許多工作要做，很多方法正處于發(fā)展階段，目前的微qPCR已經(jīng)可以滿足法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的需要，但在實(shí)際法醫(yī)DNA樣本分析中應(yīng)用的報(bào)道還很少。傳統(tǒng)的qPCR方法可以同時(shí)進(jìn)行男性/總DNA定量或基因組/線粒體DNA定量，這完全可以擴(kuò)展到微流控裝置上進(jìn)行[36]。

3.2 短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）復(fù)合擴(kuò)增

在過(guò)去的20年中，STR分型已成為被普遍接受的進(jìn)行個(gè)體識(shí)別的金標(biāo)準(zhǔn)[38]在微流控PCR芯片上進(jìn)行STR位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)。Lagally等[39-40]和Waters等[41]完成了牙釉原蛋白基因（amelogenin）片段的擴(kuò)增。Legendre等[42]用AmpFlSTR?、COfilerTM和ProfilerTM試劑盒在芯片上實(shí)現(xiàn)STR片段的擴(kuò)增。Schmidt等[43]用PowerPlex16擴(kuò)增試劑盒在芯片上實(shí)現(xiàn)1μl體系擴(kuò)增。Legendre等[42]報(bào)道的STR位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增體系只有200nL，熱循環(huán)在100min內(nèi)完成。

傳統(tǒng)的整個(gè)DNA STR分析過(guò)程需要8-10小時(shí)，其主要原因是PCR過(guò)程耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)（大于3小時(shí)）[44]。在法醫(yī)實(shí)際中，往往需要對(duì)DNA進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速分析，這也一直是法醫(yī)工作者們的共同追求目標(biāo)。研究者們?cè)谶@方面做了很多工作。Liu等[45]擴(kuò)增9個(gè)STR位點(diǎn)用時(shí)45min。Hagan[46]等用紅外線加熱的方法，在45min內(nèi)擴(kuò)增16個(gè)STR位點(diǎn)，得到這些位點(diǎn)的完整分型結(jié)果。

而在性侵害案件中，往往也需要做Y染色體的STR分型。Liu等[47]設(shè)計(jì)了種便攜式PCR-CE裝置，在1.5小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)釉原蛋白（amelogenin）基因座和3個(gè)Y-STR基因座（DYS390, DYS393, DYS439）的復(fù)合擴(kuò)增及電泳分離。并對(duì)實(shí)際案件中的檢材（口腔試子和人骨骼）進(jìn)行擴(kuò)增，4個(gè)位點(diǎn)全部成功擴(kuò)出。

上述報(bào)道的微流控PCR芯片技術(shù)的應(yīng)用，都集成了樣品DNA的提取、純化或（和）電泳檢測(cè)功能，這使得樣品的處理更加自動(dòng)化，減少了人為操作造成污染的可能。Bienvenue等[48]成功制作了集成樣本DNA的固相提取和PCR-STR位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增的芯片，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜生物樣本（全血和精斑）DNA的提取和擴(kuò)增，但加熱和對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳分析都是依賴傳統(tǒng)的方式。最近，Liu等[45]展示了種新的集成微流控系統(tǒng)，用探針進(jìn)行序列特異性DNA純化后，在線注入PCR-CE微系統(tǒng)，在PCR后對(duì)反應(yīng)腔進(jìn)行清洗，并用這種系統(tǒng)對(duì)來(lái)自口腔試子樣本的DNA完成了快速STR分型。

目前，雖然在微流控PCR芯片上進(jìn)行STR位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增已經(jīng)得到很大的發(fā)展，但位點(diǎn)丟失的問(wèn)題還沒(méi)有得到有效的解決，這需要進(jìn)一步優(yōu)化用于這種芯片STR復(fù)合擴(kuò)增的擴(kuò)增試劑，達(dá)到甚至超過(guò)傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)，可以用于不同種類的樣本（如各種液體、斑痕樣本，降解或（和）含有抑制劑的樣本，低拷貝數(shù)樣本等）。當(dāng)完全發(fā)展起來(lái)時(shí),微流控PCR技術(shù)無(wú)疑能很大程度地減少法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的時(shí)間和成本。

3.3 展望

在過(guò)去的十年多中，微流控PCR芯片技術(shù)快速發(fā)展。理想的PCR是在低體積的反應(yīng)體系下實(shí)現(xiàn)快速有效的擴(kuò)增。與傳統(tǒng)的PCR儀相比，微流控PCR芯片實(shí)現(xiàn)了低體積擴(kuò)增，但隨后是否要降低反應(yīng)體系中DNA的量還沒(méi)有進(jìn)行充分的論證。每種PCR擴(kuò)增方式都有自身的優(yōu)點(diǎn)和不足，要真正實(shí)現(xiàn)低成本、低體積、高速度和高效率可能還需要一定的時(shí)間。這些目標(biāo)實(shí)現(xiàn)時(shí)，將會(huì)真正發(fā)揮出微流控PCR芯片的優(yōu)勢(shì)。

在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)分析中，微流控PCR芯片已開(kāi)始嶄露頭角。法醫(yī)學(xué)家們可以根據(jù)實(shí)際的需要，設(shè)計(jì)制作單模（僅用于PCR擴(kuò)增）的微裝置和全集成（集DNA提取、純化、擴(kuò)增和分離檢測(cè)于一體）的微裝置。單模的更易實(shí)現(xiàn)高通量，在成批次地處理大量待檢DNA樣本方面有優(yōu)勢(shì)，而全集成的微裝置更適合現(xiàn)場(chǎng)分析和需要快速出結(jié)果的重要案件。目前已有用這些裝置在實(shí)際案件中進(jìn)行快速現(xiàn)場(chǎng)分析中試用[45]，但還沒(méi)有大規(guī)模投入使用。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，將改變現(xiàn)有的DNA檢驗(yàn)方法，利用微流控分析技術(shù)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速、高效地處理案件。

[1] 陳文元，張衛(wèi)平.集成微流控聚合物PCR芯片.上海交通大學(xué)出版社,2008,18.

[2] Manz A, Widmer HM: Miniaturized total chemical analysis systems: a novel concept for chemical sensing.Sensors Actuators B,1990(1):244-248.

[3] Shoffner M A, Cheng J, Hvichia G E, etal.Surface passivation ofmicrofabricated silicon-glass chips for PCR.Nucleic Acids Research, 1996, 24(2):375-379.

[4] 林炳承，秦建華.圖解微流控芯片實(shí)驗(yàn)室.科學(xué)出版社,2008,46.

[5] ObeidPJ，ChristopoulosTK.，CrabtreeH.J，Backhouse CJ.Continuous-flow DNA andRNA amplification chip combined with laser-induced fluorescence detection.Anal.Chem.2003,494(1-2):1-9.

[6] Frey O, Bonneick S, Hierlemann A.et al.Autonomous microfluidic multi-channel chip for real-time PCR with integrated liquid handling.Biomedical Microdevices.2007, 9,(5), 711-718.

[7] KarlssonJM,HaraldssonT,LaaksoS,etal.PCR on a PDMS-based microchip with integrated bubble removal.Transducers’11,Beijin g,China,June5-9,2011:2215-2218.

[8] Chen J F, Wabuyele M, Chen H, Patterson D.et al.Electrokinetically Synchronized Polymerase Chain Reaction Microchip Fabricated in Polycarbonate.Anal.Chem., 2005, 77(2),658-666.

[9] Krishnan M, Agrawal N, Burns M.etal.Reactions and Fluidics in Miniaturized Natural Convection Systems.Anal.Chem.,2004,76(21),6254-6265.

[10] Maturos T, Pogfay T, Mongpraneet S, et al.Temperature cycle and Surface Treatment Study of Thermoelectric Based Micro PCR.Proceedings of the 2010 5th IEEE International Conference on Nano/Micro Engineered and Molecular Systems.January 20-23,Xiamen, China:712-715.

[11] GuijtR M, DodgeA ,Gijs WK.Chemical and physical processes for integrated temperature control in microfluidic devices.Lab Chip,2003, 3, 1-4.

[12] Zhang C X, Xing D, Li Y Y, et al.Micropumps, microvalves, and micromixers within PCR microfluidic chips: Advances and trends.Biotechnology Advances,2007,5(25):483-514.

[13] Chou C.F, Changrani R, RobertsP, et al.A miniaturized cyclic PCR device—modeling and experiments.Microelectronic Engineering, 2002(61-62):921-925.

[14] Liu J, EnzelbergerM, Quake S.A nanoliter rotary device for polymerase chain reaction.Electrophoresis 2002(23):1531-1536.

[15] Joung SR, Kim J, Choi Y J, et al.ITO-coated glass/polydimethylsiloxane continuous-flow PCR chip.Proceedings of the 2nd IEEE InternationalConference on Nano/Micro Engineered and Molecular Systems,January 16 - 19, 2007, Bangkok,Thailand: 691-694.

[16] XuZR,WangX,FanXF,et al.An extrusion fluidic driving method for continuous-flow polymerase chain reaction on a microfluidic chip.MicrochimActa (2010) 168:71-78.

[17] Legendre LA, Bienvenue JM, Roper MG, et al.A Simple,Valveless Microfluidic SamplePreparation Device for Extraction andAmplification of DNA from Nanoliter-VolumeSamples.Anal.Chem.2006(78):1444-1451.

[18] Leslie DC，Seker E，Bazydlo LA， et al.Platinum nanoparticlefacilitated reflective surfaces for non-contacttemperature control in microfluidic devices for PCR amplification.Lab Chip, 2012, 12,127-132.

[19] OdaRP，Strausbauch MA，R.Huhmer AF, et al.Infrared-Mediated Thermocycling for Ultrafast Polymerase Chain Reaction Amplification of DNA.Anal.Chem., 1998, 70 (20)：4361-4368.

[20] Phaneuf CR, Pak N, Saunders DC, et al.Rapid, independent controlled polymerase chain reaction VIA multiple laser radiation.15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences.October 2-6, 2011, Seattle,Washington, USA ：1689-1691.

[21] Northrup MA，Ching MT，White RM.et al.DNA amplification with a microfabricated reaction champer.Transducers (Yokohama,Japan) 1993:924-6.

[22] PoserS,SchulzT,DillnerD,etal.Chip elements for fast thermocycling.Sensors and Actuators A: Physical 1997(62):672-675.

[23] OhKW,Park C, Namkoong K, et al.World-to-chip microfluidic interface with built-in valves for multichamberchip-based PCR assays.Lab Chip, 2005(5): 845-850.

[24] Shaw K J, Docker P T, Yelland J, et al.Rapid PCR amplification using a microfluidic device with integratedmicrowave heating and air impingement cooling.Lab Chip, 2010（10）：1725-1728.

[25] Sundberg SO, Wittwer CT, GaoC, et al.Spinning Disk Platform for Microfluidic Digital Polymerase Chain Reaction.Anal.Chem.,2010(82):1546-1550.

[26] Kopp MU, Mello AJ, Manz A, et al.Chemical amplification:continuous-flow PCR on a chip [J].Science, 1998, 280(5366):1046～1048.

[27] Chiou J, Matsudaira P, Sonin A, et al.A Closed-Cycle Capillary Polymerase Chain Reaction machine.Analytical Chemistry, 2001 73(9):2018-2021.

[28] Chung K H, Choi Y N, Jung M Y, et al.Natural Convection PCR in a Disposable Polymer Chip.IEEE SENSORS 2009 Conference.1217-1220.

[29] 薛輝, 王瑋, 李志信等.自然對(duì)流型 PCR 芯片的熱分析和設(shè)計(jì).工程熱物理學(xué)報(bào), 吉林, 2005(26), 140-142.

[30] Zhang C X, Xing D.Parallel DNA amplification by convective polymerase chain reaction with various annealing temperatures on a thermal gradient device.Analytical Biochemistry.2009,1(387):102-112.

[31] Chung KH, Choi YH, Kim BK.Fast PCR utilizing buoyant convection in a disposable chip.Micro Electro Mechanical Systems(MEMS), 2011 IEEE 24th International Conference.23-27 Jan.2011 :865-868.

[32] Wang F, Burns M A.Performance of nanoliter-sized dropletbased microfluidic PCR.Biomed Microdevices (2009) 11:1071-1080.

[33] 劉金華,殷學(xué)鋒,方肇倫.螺旋通道微流控PCR芯片連續(xù)自動(dòng)擴(kuò)增DNA片段的研究.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25（1）：30-34.

[34] Wang W， Li ZX， Yang, YJ，et al.Droplet based micro oscillating flow-through PCR chip.Micro Electro Mechanical Systems, 17th IEEE International Conference on.(MEMS)，2004：280-283.

[35] Bu M Q, Melvin T, Ensell G, et al.Design and theoreticalevaluation of a novel microfluidic device to be used for PCR.Journal of Micro mechanicsandMicroengineering, 2003, 13:125-130.

[36] Horsman K M, Bienvenue J M, Blasier K R, et al.Forensic DNA Analysis on Micro-uidicDevices: A Review.Forensic Sci,2007, 52（4）：784-799.

[37] YingjieYu,Bowei Li, Baker C A, et al.Quantitative Polymerase Chain Reaction Using Infrared Heating on a Microfluidic Chip.Anal.Chem.2012, 84, 2825-2829.

[38] Hagan KA, Norris JV, Root BE, et al.PCR AMPLIFICATION OF STR LOCI USING AN INFRARED LASER SOURCE.15th International Conference onMiniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences,October 2-6, 2011, Seattle, Washington,USA:365-367.

[39] Lagally ET, Simpson PC, Mathies RA.Monolithic integrated microfluidic DNA amplification and capillary electrophoresis analysis system.Sens Actuators B Chem 2000;63(3):138-46.

[40] Lagally ET, Emrich CA, Mathies RA.Fully integrated PCR-capillaryelectrophoresis microsystem forDNA analysis.Lab Chip,2001,1(2):102-7.

[41] Waters LC, Jacobson SC, Kroutchinina N, et al.Microchip device for cell lysis, multiplex PCR amplification, and electrophoretic sizing.Anal Chem 1998;70(1):158-62.

[42] Legendre LL, Bienvenue JM, Ferrance JP, et al.Multiplexmicrochip PCR for STR analysis.The 15th International Symposiumon Human Identification; 2004 October; Phoenix, AZ.Madison, WI:Promega Corp., 2004.

[43] Schmidt U, Lutz-Bonengel S, WeisserHJ,et al.Low-volume amplification on chemically structured chipsusing the PowerPlex16 DNA amplification kit.Int J Legal Med2006;120(1):42-8.

[44] Hagan KA, Norris JV, Root BE, et al.PCR amplification of STR loci using an infrared laser source.15th International Conference onMiniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences，October 2-6, 2011, Seattle, Washington, USA：365-367.

[45] Liu P, Li X J, Greenspoon S A, et al.Integrated DNA purification,PCR, sample cleanup, and capillaryelectrophoresis microchip for forensic human identification.Lab Chip, 2011,11：1041-1048.

[46] Hagan K A, Reedy C R, Bienvenue J M, et al.Avalvelessmicrofluidic device for integrated solid phase extraction andpolymerase chain reaction for short tandem repeat (STR)analysis.Analyst,2011,136:1928-1937.

[47] Liu P, Seo T S, Beyor N, et al.Integrated Portable Polymerase ChainReaction-Capillary Electrophoresis Microsystemfor Rapid Forensic Short Tandem Repeat Typing.Anal.Chem.2007,79:1881-1889.

[48] Hopwood A J, Hurth C, Yang J, et al.Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile.Anal.Chem.2010, 82： 6991-6999.