王兆輝 王學春

(泰山醫(yī)學院病理學教研室，山東 泰安 271000)

轉移是惡性腫瘤的本質屬性之一，也是患者死亡的主要原因。臨床資料表明，Notch1分子與多種腫瘤的轉移密切相關。在乳腺癌患者原發(fā)癌組織中，轉移組和非轉移組中的Notch1分子表達水平存在顯著差異，并且與轉移呈正相關。近些年發(fā)現(xiàn)，乳腺癌干細胞遷徙性增強是導致乳腺癌轉移的根源。Notch1分子可能通過促進乳腺癌干細胞自我更新和增殖，以及增強乳腺癌干細胞的遷徙活性促進轉移的發(fā)生。

1 Notch分子簡介

Notch是一個約300 kDa的單次I型跨膜蛋白，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)。胞外區(qū)是與其配體結合而激活信號通路的部分，當配體與受體結合后受體暴露出TACE金屬蛋白酶結合位點，在TACE金屬蛋白酶作用下胞外部分發(fā)生水解，裂解片段N段部分(胞外部)被配體表達細胞內吞，C端裂解片段在γ-分泌酶的作用下發(fā)生二次水解，釋放Notch受體的活化形式 (NICD/ICN)，NICD/ICN片段經過核孔進入細胞核，與DNA結合蛋白CSL/CBFI/RBP-Jκ結合，啟動下游靶基因(Hes、Hey)的轉錄。在哺乳動物中，Notch受體可以分為四個類型：notch1～4。人的Notch配體種類有Dlll、3、4和Jaggedl、2等共五種。

Notch信號通路在胚胎發(fā)育、成體干細胞的自我更新或其沿著特定系譜方向分化等方面起著重要的調控作用。受細胞周圍環(huán)境和發(fā)育環(huán)境雙重作用，Notch信號通路直接決定細胞的增殖、凋亡、分化及遷移。因此，Notch信號通路對于維持機體正常發(fā)育和穩(wěn)態(tài)起著十分重要的作用。

但是Notch信號通路的異常激活卻與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。自1991年首次在人類T淋巴母細胞白血病中發(fā)現(xiàn)Notch受體的異常表達外，以后又在宮頸癌、子宮內膜癌、腎癌、肺癌、乳腺癌、髓母細胞瘤和黑色素瘤等許多系統(tǒng)的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)Notch信號通路異常激活[1-4]。

2 Notch1分子在乳腺癌轉移過程中的作用

最早在研究小鼠乳腺瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)感染導致乳腺癌模型時發(fā)現(xiàn)，MMTV逆轉錄DNA序列會整合到小鼠Notch4基因中，導致Notch4蛋白的異常表達[5]。后來研究者將編碼Notch4胞內片段(NICD/ICN)的基因序列導入小鼠體內并使其表達，結果小鼠發(fā)生了乳腺癌，并且很快轉移到肺[6]。以后的研究發(fā)現(xiàn)，在人類乳腺癌發(fā)展進程中，無論是乳腺原位癌還是浸潤性乳腺癌都有Notch信號通路的異常激活，包括在導管內原位癌和浸潤性乳腺癌都有Notch受體過表達[7]，在浸潤性乳腺癌中存在高水平的Notch配體[8-9]、Notch下游靶基因(hes或hey)的轉錄以及Notch的抑癌基因Numb失表達[10]，提示Notch信號通路異常激活在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。而且Notch1分子與乳腺癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤等許多腫瘤轉移密切相關[11-14]。在乳腺癌患者原發(fā)癌組織中，轉移組和非轉移組中的Notch1分子表達水平存在顯著差異，并且與轉移呈正相關[15]。相反，使用添加Notch信號通路阻斷劑飼養(yǎng)移植模型鼠，或者對其所接種的乳腺癌干細胞沉默Notch1基因表達，都可以明顯減少移植瘤的發(fā)生[16]。

花本林等[17]應用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測60例乳腺癌組織和25例癌旁正常乳腺組織Notch1和Jag1的表達,發(fā)現(xiàn)人類乳腺癌中廣泛存在Notch1和Jag1的高表達,而在癌旁正常乳腺組織呈現(xiàn)Notch1和Jag1的低表達和不表達，并且Notch1表達水平與乳腺癌轉移、組織學分級、臨床分期呈正相關。Reedijk M等[11]應用原位雜交技術分析了Notch相關配體受體在184例人乳腺癌組織的表達情況，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌預后差的病理亞群中存在Notch1和Jag1的高表達，Notch1、Jag1的高表達患者生存期會縮短。而且如果乳腺癌組織Notch1和Jag1二者水平都較高，患者5年生存率明顯下降。Farnie G等[18]發(fā)現(xiàn)，如果乳腺導管內原位癌組織Notch1受體細胞內片段NICD高表達，患者術后復發(fā)時間會縮短，約為術后5年。這些發(fā)現(xiàn)表明，Notch1是重要的促進乳腺癌轉移的分子。

3 Notch1促進乳腺癌轉移的相關機制

癌干細胞理論認為，在腫瘤組織中存在一類特殊細胞，移植到實驗鼠體內可以增殖形成新的瘤組織，并且該瘤組織在細胞形態(tài)、組織學類型、特異性抗原的表達方面都與原發(fā)瘤完全一致。這類細胞通過自我更新和增殖，維持自身在機體中穩(wěn)定存在，通過向其他不同瘤細胞亞群分化重新形成腫瘤組織[19]。 2003年，Al-Hajj等[20]首次分離出表型為CD44+/CD24-/low/ESA+的人乳腺癌干細胞，以200個的數(shù)目注射到裸鼠體內，形成了有親代異質性的移植瘤，而非該表型細胞致瘤性卻極差。以后Balic等[21]在早期乳腺癌患者骨髓中發(fā)現(xiàn)，一些散在的瘤細胞呈CD44+/CD24-/low表型。提示CD44+/CD24-/low表型的乳腺癌干細胞還具有很強的遷徙活性。 有遷徙活性的乳腺癌干細胞無疑是導致乳腺癌轉移發(fā)生的“根源”。而Notch1分子通過作用于乳腺癌干細胞，影響其存活、增殖、遷移等活性，促進乳腺癌轉移的發(fā)生。

3.1Notch1分子促進乳腺癌干細胞自我更新和增殖，維持乳腺癌干細胞表型

由于已分化的細胞生活周期短，無法完成多個基因變異的積累，而干細胞具有自我更新、長期存活和相對無限增殖等特點，可以為多基因突變積累提供足夠時間，因此很多學者認為，腫瘤干細胞來源于正常干細胞，并具有干細胞很多特征性屬性[19-22]。Notch分子是參與調控干細胞分化的受體蛋白，正常乳腺細胞不表達或低表達，而在乳腺癌干細胞中，Notch信號相關分子呈異常高表達[7]。Notch1分子對乳腺癌干細胞的產生起著重要作用。McGowan等[16]發(fā)現(xiàn)，和普通未作任何處理的乳腺癌干細胞組相比，將沉默Notch1基因的乳腺癌干細胞導入小鼠體內后，移植瘤發(fā)生率明顯下降。

Notch1分子促進乳腺癌干細胞自我更新和增殖，提高乳腺癌干細胞在機體內的存留時間和濃度，增加乳腺癌干細胞轉移機會。Farnie G等[18]利用細胞表面標志物CD44+/CD24-/low從乳腺癌患者體內分離乳腺癌干細胞，發(fā)現(xiàn)Notch基因在乳腺癌干細胞呈高異常表達。他們利用無粘連微球懸浮培養(yǎng)技術培養(yǎng)乳腺癌干細胞，這些乳腺癌干細胞可以形成懸浮無粘連微球。加入γ-分泌酶抑制劑DAPT、Notch4封閉抗體能夠減少微球的形成。Kondratyev M等[23]從ERBB2小鼠乳腺癌組織分離出乳腺癌干細胞，這些細胞在體外懸浮培養(yǎng)下形成無粘連微球，當加入γ分泌酶抑制劑MRK-003后，微球的生成減少。這些經MRK-003處理的細胞移植到同源小鼠體內不能形成移植瘤。MRK-003還可以通過誘導腫瘤細胞分化或者凋亡，可以長時間逆轉乳腺癌小鼠回到正常狀態(tài)。Dontu等[24]懸浮培養(yǎng)正常乳腺干細胞微球發(fā)現(xiàn)，增加激活Notch 信號的DSL 信號肽，次級微球體增加10 倍，同時激活Notch 信號還可作用于多潛能祖細胞，促進肌上皮細胞增生。而這一現(xiàn)象可以被Notch4封閉性抗體或者γ分泌酶抑制劑所阻斷。Harrison H等[25]分別用DAPT，Notch4基因沉默，Notch1基因沉默處理單層培養(yǎng)的乳腺癌細胞株MCF7，與普通培養(yǎng)的乳腺癌細胞相比，使用DAPT培養(yǎng)的細胞中CD44+/CD24-/low/ESA+表型細胞減少約30%，Notch4沉默培養(yǎng)的細胞中CD44+/CD24-/low/ESA+表型細胞減少約50%，Notch1沉默培養(yǎng)的細胞中CD44+/CD24-/low/ESA+表型細胞減少約15%。而且激活Notch信號會提高乳腺癌干細胞對輻射耐受[26]，在使用一定劑量射線輻射無粘連懸浮培養(yǎng)乳腺癌微球后，NICD表達明顯增加，乳腺癌干細胞比例也隨之增加。

以上研究表明，Notch信號分子對于促進乳腺癌干細胞自我更新和增殖，維持癌干細胞表型有重要作用。Notch分子表達上調，促進乳腺癌干細胞的自我更新和增殖。沉默Notch基因或阻斷Notch信號通路，可誘導乳腺癌干細胞分化或凋亡，逆轉乳腺癌進程。李傳偉等認為[27]，當乳腺干細胞經歷多次致瘤性的打擊以后，Notch信號通路就可能被異常激活。同時參與調控細胞增殖分化的功能隨之發(fā)生紊亂，細胞分化基因失活，而增殖基因激活，導致乳腺癌的發(fā)生。如果阻斷乳腺癌Notch信號通路，可以逆轉乳腺癌進程，會使乳腺癌細胞重新分化或凋亡。

3.2Notch1分子增強乳腺癌干細胞遷徙活性

在腫瘤轉移過程中惡性上皮細胞間黏附性降低，細胞獲得足夠的移動能力從原發(fā)腫瘤解離，穿過細胞外間質侵入血管，播散到遠隔器官后侵出定植并導致繼發(fā)腫瘤。而上皮細胞間質轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT)在腫瘤細胞的侵襲和遠處轉移中起著重要作用[28]。EMT是具有極性的上皮細胞轉換成具有活動能力、能夠在細胞基質間自移動的間質細胞表型的過程[29]。包括細胞黏附分子(E-cadherin)表達減少；角蛋白為主的細胞骨架轉變?yōu)椴ㄐ蔚鞍诪橹鞯募毎羌?，并且引起細胞形態(tài)的改變。

Mani等[30]利用轉錄因子TWIST 、SNAIL及生長因子TGF-β1誘導永生化乳腺上皮細胞發(fā)生EMT，發(fā)現(xiàn)這些EMT細胞表達CD44+/CD24-/low，另外上皮細胞相關標志物E-cadherin表達減少，間葉組織標志物N-cadherin、纖維蛋白和波形蛋白的表達上升。Morel等[31]通過激活RAS/MAPK信號通路也成功誘導永生化乳腺上皮產生CD44+/CD24-/low表型細胞。這些CD44+/CD24-/low細胞表現(xiàn)出明顯的E-cadherin含量減少，N-cadherin、纖維蛋白和波形蛋白的表達上升，以及FoxC2、Snail、Twist和Slug的高表達，提示有遷徙活性的CD44+/CD24-/low表型細胞可能來自EMT轉化細胞。

Zavadil J等[32]發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導的乳腺上皮細胞EMT需要Notch信號通路的激活實現(xiàn)，如果沉默HEY1或JAG1基因，或者使用Notch抑制劑都可以阻斷EMT的發(fā)生。Stylianou小組[11]發(fā)現(xiàn)正常乳腺上皮細胞株MCF10A持續(xù)表達RBP-Jκ/VP16 或 NICD導致細胞形態(tài)發(fā)生改變，E-cadherin表達顯著減少。提示Notch信號通路對乳腺癌細胞遷徙性的產生起著十分重要的作用。

在腫瘤組織中低氧刺激可以提高腫瘤細胞的轉移潛能，并與腫瘤的預后不良密切相關[33-34]，低氧可以激活Notch信號通路，使上皮細胞向間質細胞表型轉化，增強細胞的運動能力、增加細胞侵襲力以改變這種低氧刺激。Timmerman等[35]發(fā)現(xiàn)，阻斷Notch信號通路可以消除低氧引起的EMT和侵襲，相反激活Notch信號通路可以取代低氧直接引起EMT。

有研究報道，在腫瘤轉移過程中，癌細胞首先通過EMT而獲得遷徙活性，包括對周圍組織的浸潤和遠處器官的轉移，但是當這些過程完成以后，細胞通過間質細胞上皮轉型重新獲得增殖能力[36]。

雖然激活Notch通路都可以增強乳腺癌細胞的遷徙活性，但是臨床資料顯示，Notch1分子與乳腺癌的轉移的相關性更為密切。對于Notch1分子在乳腺癌轉移過程中的確切機制，目前并不十分清楚，還需做大量更深入的研究。

綜上所述，Notch1通過促進乳腺癌干細胞自我更新和增殖，提高乳腺癌干細胞遷徙活性，以此促進乳腺癌的轉移。然而，乳腺癌轉移是一個多步驟的十分復雜的過程，這些過程還要涉及癌細胞進入血道或淋巴道、瘤細胞的歸巢和增殖、轉移組織器官的選擇等多個方面。由于沒有很好的研究手段，目前對于乳腺癌轉移的相關機制，僅停留在假說階段，很多假說還未得以證實。相信隨著研究技術的進步，研究方法和研究模型的改進，乳腺癌轉移的更深層次機制一定可以獲得澄清。在不久的將來乳腺癌轉移一定能夠得到有效控制，患者的生存時間、生活質量從而得到大幅提升。

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