金 芳，李 垚，劉紅南，張 琳，劉 瑩，馮香安

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030）

蛋白質(zhì)是生物體中廣泛存在的一類(lèi)生物大分子，是生命的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的吸收在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育中起關(guān)鍵作用，是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)吸收的關(guān)鍵物質(zhì)。添加劑的作用不僅僅只是促進(jìn)生長(zhǎng)，一些添加劑已成為促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收或保證動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理功能正常發(fā)揮所必需的物質(zhì)，也是全價(jià)飼糧中必不可少的組成部分，而不單單只是看作飼料中額外添加的成分。天然的功能性飼料添加劑是目前動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)中研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，其中一部分已在飼料工業(yè)和畜禽養(yǎng)殖中得到應(yīng)用，并取得了初步效果，不同程度地提高了飼料利用率、動(dòng)物的生長(zhǎng)速度、機(jī)體免疫力，改善了畜禽的肉質(zhì)并減少了對(duì)環(huán)境的污染。其中黃酮類(lèi)化合物作為飼料添加劑越來(lái)越受到專(zhuān)家學(xué)者的重視。

1 黃酮類(lèi)化合物的生理活性

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)重要的天然有機(jī)化合物，泛指由兩個(gè)芳環(huán)（A與B）通過(guò)三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物，其基本結(jié)構(gòu)為C6-C3-C6，是植物在長(zhǎng)期自然選擇過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物。其廣泛存在于羊齒植物及高等植物的根、莖、葉、花、果實(shí)中，不僅數(shù)量種類(lèi)繁多，而且結(jié)構(gòu)類(lèi)型也復(fù)雜多樣，到目前為止已發(fā)現(xiàn)8000多種，在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷，部分以游離形式存在。天然黃酮類(lèi)化合物是植物體多酚類(lèi)的內(nèi)信號(hào)分子及中間體或代謝物，包括黃酮、異黃酮、黃酮醇、異黃酮醇、黃烷酮、異黃烷酮、查耳酮等。從天然植物中提取的重要的黃酮類(lèi)化合物有黃羊苷、芫花素、槲皮素、蘆丁、葛根素、甘草苷等。

黃酮類(lèi)化合物因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)而具有許多重要的生理、生化作用。黃酮類(lèi)化合物具有高度的化學(xué)反應(yīng)性，能清除生物體內(nèi)的自由基，具有抗氧化作用。大豆黃酮是有效的過(guò)氧化氫清除劑，Wei等研究證明，大豆異黃酮既能在體內(nèi)又能在體外顯著抑制佛波醇酯等腫瘤促進(jìn)劑誘導(dǎo)的H2O2的形成（P＜0.05）[1]。黃酮類(lèi)化合物還具有抑制酶的活性、抗癌、抗病毒、抗菌、抗炎癥、抗過(guò)敏、抗疲勞、抗糖尿病并發(fā)癥等功能，且無(wú)毒無(wú)害，對(duì)人類(lèi)的腫瘤、衰老、心血管病等退變性疾病的治療和預(yù)防有重要意義。Mishra等使用兩種不同劑量的大豆黃酮（0.5和50mg·kg-1）灌胃二甲基苯丙蒽誘導(dǎo)的致癌動(dòng)物10 d，發(fā)現(xiàn)經(jīng)大豆黃酮處理的處于青春期前的大鼠，與對(duì)照組相比，其癌癥發(fā)生率為37.4%（P＜0.05），并且在50mg·kg-1劑量組中，一些抗氧化物酶的特異性活動(dòng)顯著增加（P＜0.05）[2]。

2 黃酮類(lèi)化合物在飼料添加劑中的應(yīng)用

作為飼料添加劑的黃酮類(lèi)化合物主要有大豆異黃酮、沙棘黃酮、伊普異黃酮等[3]。黃酮類(lèi)化合物應(yīng)用于飼料添加劑，可以提高動(dòng)物采食量、生產(chǎn)性能及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率，并能夠提高生長(zhǎng)速度和免疫功能以及反芻動(dòng)物乳腺的發(fā)育和泌乳[4-6]。

2.1 大豆異黃酮

大豆異黃酮類(lèi)化合物作為飼料添加劑使用時(shí)，通常可作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育；作為免疫增強(qiáng)劑，增強(qiáng)畜禽的抗病力，減少因疾病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)效益下降；作為催情劑，增加排卵率和產(chǎn)仔數(shù)量，提高動(dòng)物的繁殖性能[7-10]。因此，大豆異黃酮作為一種新型飼料添加劑具有較大研究?jī)r(jià)值和廣闊的開(kāi)發(fā)前景。當(dāng)然，也可能有潛在的副作用，山羊長(zhǎng)期采食含天然大豆異黃酮豐富的三葉草會(huì)患“三葉草病”，即繁殖障礙病。尚需進(jìn)一步研究處于不同生理階段的不同動(dòng)物飼喂大豆異黃酮的適宜添加量，亦需深入研究大豆異黃酮在動(dòng)物產(chǎn)品中殘留及其對(duì)人類(lèi)健康的影響。

2.2 沙棘黃酮

沙棘黃酮也屬于植物黃酮類(lèi)物質(zhì)，沙棘中最主要的黃酮類(lèi)化合物為槲皮素、異鼠李素、異鼠李素-3-β-D-蕓香糖苷、異鼠李素-3-β-D-葡萄糖苷、山萘酚及其苷類(lèi)、蘆丁等。沙棘含豐富的抗氧化、防腐物質(zhì)，從而非常有利于貯存；沙棘飼料有利于畜禽體質(zhì)發(fā)育，尤其對(duì)畜禽產(chǎn)仔、產(chǎn)蛋等生殖生命活力具有促進(jìn)作用；飼喂禽類(lèi)時(shí)應(yīng)控制沙棘飼料的比例，因其含有粗纖維禽類(lèi)不能很好地消化；其內(nèi)含的酚類(lèi)物質(zhì)有影響禽類(lèi)消化的作用，故作禽類(lèi)飼料時(shí)必須進(jìn)行脫毒處理。有研究表明，沙棘是一種含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類(lèi)多、含量豐富、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的優(yōu)良畜禽飼料資源[11]。

2.3 伊普異黃酮

伊普異黃酮（7-異丙氧基異黃酮）與大豆黃酮有相似的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，是一種人工合成的異黃酮植物雌激素，其具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、抑制成熟破骨細(xì)胞募集、促進(jìn)膠原合成和基質(zhì)分化、增加骨密度等作用。

3 黃酮類(lèi)化合物促進(jìn)蛋白質(zhì)吸收的機(jī)制

皮雄娥等研究報(bào)道，微量的大豆異黃酮可顯著促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的沉積[12]。其直接作用于肌肉細(xì)胞的雌激素受體，使肌細(xì)胞增大，從而促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)的積累；促進(jìn)肝臟蛋白質(zhì)合成，使血漿蛋白水平發(fā)生變化，即血清白蛋白、球蛋白和纖維蛋白的含量升高；通過(guò)與下丘腦、垂體等雌二醇受體結(jié)合，降低生長(zhǎng)抑素水平，從而提高胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-Ⅰ）和生長(zhǎng)激素（GH）水平，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)；異黃酮植物雌激素在下丘腦與雌二醇競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雌二醇受體，發(fā)揮抗雌激素作用，并削弱了雌二醇的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，引起內(nèi)源性睪酮的增加，促進(jìn)了雄性動(dòng)物蛋白質(zhì)合成。艾曉杰等報(bào)道，大豆黃酮通過(guò)減少機(jī)體尿素氮的產(chǎn)生而增加氮的保留，即體內(nèi)蛋白質(zhì)分解下降，而合成代謝加強(qiáng)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的氮代謝水平，影響分娩后初產(chǎn)奶牛的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝，促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，加強(qiáng)了機(jī)體蛋白質(zhì)的合成，以適應(yīng)機(jī)體泌乳的生理變化[13]。

陶勝宏等研究報(bào)道，伊普異黃酮作用于下丘腦-垂體-甲狀腺軸，促進(jìn)促甲狀腺激素（TSH）的分泌，繼而引起血液中甲狀腺激素的升高，并促進(jìn)了脫碘酶的活性，使血清四碘甲狀腺尿氨酸（T4）、游離型四碘甲狀腺尿氨酸（FT4）向更具活性的三碘甲狀腺尿氨酸（T3）、游離型三碘甲狀腺尿氨酸（FT3）轉(zhuǎn)化，從而影響了肉雞體內(nèi)各種代謝水平，并顯著降低了公雞和母雞血清中尿酸的含量（P＜0.05），表明蛋白質(zhì)在機(jī)體內(nèi)沉積的加劇，促進(jìn)了肉雞的生長(zhǎng)[14]。故伊普異黃酮對(duì)肉雞的促生長(zhǎng)作用是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)甲狀腺激素水平、促進(jìn)蛋白質(zhì)在體內(nèi)的沉積來(lái)實(shí)現(xiàn)的，且沒(méi)有顯著的性別差異。劉紅南等在研究沙棘葉總黃酮對(duì)肉雞蛋白質(zhì)利用的影響中，利用十二指腸組織差異蛋白質(zhì)檢測(cè)證實(shí)了沙棘葉總黃酮可以通過(guò)上調(diào)十二指腸核糖體蛋白S12（RPS12）、腸道脂肪酸結(jié)合蛋白（Ⅰ-FABP）和角蛋白10（CK10）的表達(dá)，提高21日齡AA肉雞生長(zhǎng)前期蛋白質(zhì)表觀消化率，促進(jìn)胸肌和腿肌的生長(zhǎng)發(fā)育[15]。

4 黃酮類(lèi)化合物對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)消化吸收的影響

4.1 家禽

李垚等研究表明，沙棘黃酮可以提高飼料中蛋白質(zhì)和鈣的吸收利用率以及影響肉雞血清胰島素（Ins）、胰高血糖素（GG）、IGF-Ⅰ等激素水平，為進(jìn)一步研究沙棘的有效成分和對(duì)畜禽的作用及其應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)[16]。朱建平等對(duì)AA肉雞的試驗(yàn)表明，添加大豆黃酮3mg·kg-1，42日齡增重提高6%，料肉比降低4%，同活重情況下屠宰比較，胸肉重增加8%[17]。王利華等研究發(fā)現(xiàn)，肉雞血清尿酸含量在添加大豆異黃酮的前期，試驗(yàn)組較對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明大豆異黃酮對(duì)蛋白質(zhì)的積累有顯著的效果（P＜0.05）[18]。劉紅南等采用雙向電泳和蛋白鑒定的方法測(cè)定沙棘黃酮的作用效果，結(jié)果表明，沙棘黃酮促進(jìn)了肉雞幼雛十二指腸的發(fā)育，從而提高了21日齡肉雞對(duì)飼料中蛋白質(zhì)的利用率，促進(jìn)胸肌和腿肌的生長(zhǎng)發(fā)育[15]。劉燕強(qiáng)等報(bào)道，大豆黃酮使羅曼蛋雞的蛋重和飼料轉(zhuǎn)化率提高，且血液中T3、T4顯著升高（P＜0.05），提示大豆黃酮可促進(jìn)甲狀腺分泌、機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝和利用[19]。對(duì)于處于生長(zhǎng)期的動(dòng)物來(lái)說(shuō)，腸道的健康發(fā)育以及分化，對(duì)于其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和生產(chǎn)性能的提高具有至關(guān)重要的作用。添加含有豐富黃酮類(lèi)化合物的松科植物提取物可以顯著提高肉雞的腿肌率（P＜0.05）。邵淑麗等研究結(jié)果表明，沙棘嫩枝葉5%可使AA肉仔雞對(duì)日糧中蛋白質(zhì)利用率提高6.28%[20]。侯宗梅等報(bào)道，添加異黃酮植物雌激素使7～21日齡雛雞的腿肌重及腿肌中的RNA含量有較顯著的提高，同時(shí)血液中的甲狀腺激素含量顯著增加（P＜0.05）[21]。陶勝宏等研究表明，伊普異黃酮能夠顯著提高肉公雞和肉母雞血清中T3和FT3的水平（P＜0.05），TSH的水平也有所升高，而血清中T4和FT4的水平卻有下降的趨勢(shì)，還能夠顯著降低公雞和母雞血清中尿酸的含量（P＜0.05），表明蛋白質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的沉積加強(qiáng)，促進(jìn)了肉雞的生長(zhǎng)[14]。

4.2 反芻動(dòng)物

馬海田等研究認(rèn)為，飼料中添加大豆黃酮能提高山羊瘤胃液的pH，增強(qiáng)總脫氫酶活性，總脫氫酶活性及NH3-N和瘤胃微生物總蛋白含量試驗(yàn)期分別較對(duì)照期顯著提高（P＜0.05）[22]。陳杰等研究表明，水牛十二指腸灌注大豆黃酮，除升高血清睪酮水平外，同時(shí)還有效促進(jìn)了瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成，并且揮發(fā)性脂肪酸、氨態(tài)氮濃度顯著增加（P＜0.05）[23]。郝振榮等研究大豆異黃酮對(duì)泌乳后期的中國(guó)荷斯坦奶牛泌乳性能的影響，試驗(yàn)組泌乳牛血清和乳中白介素-4（IL-4）、免疫球蛋白（IgG）含量顯著升高（P＜0.05），但仍在健康的水平內(nèi)[24]。Sakai等研究表明，大豆異黃酮能夠通過(guò)IL-4間接調(diào)節(jié)IgG的分泌，IL-4能夠促進(jìn)免疫球蛋白G1和免疫球蛋白E的增加而抑制免疫球蛋白G2a的產(chǎn)生，IL-4通過(guò)激活和上調(diào)輔助T淋巴細(xì)胞2（Th2）的分泌能力，從而增加了IgG的分泌量[25]。

4.3 其他動(dòng)物

鄭元林等試驗(yàn)表明，大豆異黃酮1×10-5mol·L-1可使大鼠離體肝臟灌流液中尿素氮濃度下降，抑制大鼠離體灌流的肝組織中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）的活性，提高3H-亮氨酸的摻入量，說(shuō)明大豆異黃酮可通過(guò)增加對(duì)大鼠肝臟氮的存留，促進(jìn)大鼠肝細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成[26]。馬海田等報(bào)道，7-羥基異黃酮和伊普異黃酮均能提高大鼠的日增重，降低料重比，并有降低血清尿素氮和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的趨勢(shì)，提出7-羥基異黃酮和伊普異黃酮對(duì)雄性和雌性大鼠均有促生長(zhǎng)作用，且可能與蛋白質(zhì)的代謝有關(guān)[19]。林成招等應(yīng)用酶消化法分離培養(yǎng)了SD大鼠的小腸上皮細(xì)胞，用3H-TdR摻入法分別檢測(cè)了大豆異黃酮（大豆黃酮和染料木素）對(duì)該細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并測(cè)定了細(xì)胞堿性磷酸酶活性的變化，同時(shí)，利用翻轉(zhuǎn)的小鼠離體小腸囊研究了大豆異黃酮0、0.1、0.5、1、5 μg·mL-1對(duì)小腸葡萄糖及氨基酸吸收的影響，并檢測(cè)了小腸黏膜總ATP酶活性的變化，結(jié)果證明，大豆黃酮和染料木素對(duì)葡萄糖的吸收均有促進(jìn)作用，但是對(duì)色氨酸和賴(lài)氨酸的吸收及黏膜ATP酶的活性并沒(méi)有影響[27]。這些研究結(jié)果不完全一致可能是由于添加量的多少或者不同種類(lèi)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)方式不同引起的。

5 小 結(jié)

飼料添加劑在人們的生活中扮演著越來(lái)越重要的角色，也使現(xiàn)代動(dòng)物飼養(yǎng)效果提高到一個(gè)新水平。作為一類(lèi)最廣泛分布于植物體內(nèi)的多酚類(lèi)物質(zhì)，黃酮類(lèi)化合物潛在的作用不斷被人們發(fā)現(xiàn)和認(rèn)知。與此同時(shí)，黃酮類(lèi)化合物的廣泛利用也為畜牧行業(yè)帶來(lái)廣闊的發(fā)展前景。

[1]Wei H,Zou H,Sheikh A M,et al.IL-6 is increased in the cerebel?lum of the autistic brain and alters neural cell adhesion,migration and synapse formation[J].J Neuro Inflammation,2011,8（5）:52.

[2]Mishra P,Anand K,Raosaheb K,et al.Prevention of chemically induced mammary tumorigenesis by daidzein in pre-pubertal rats:the role of peroxidative damage and antioxidative enzymes[J].Mol Cell Biochem,2009,325（1-2）:149-157.

[3]胡亮,張明.黃酮類(lèi)添加劑在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2009（2）:71-72.

[4]Zhang G,Qin L,Hung W Y,et al.Flavonoids derived from herbal epimedium brevicornum maximprevent OVX-induced osteoporo?sis in rats independent of its enhancement in intestinal calcium absorption[J].Bone,2006,38（6）:818-825.

[5]Zafar T A,Weaver C M,Jones K,et al.Insulin effects on bioavail?ability of soy isoflavones and their calcium absorption enhancing ability[J].J Aqric Food Chem,2004,52（2）:2827-2831.

[6]Arjmandi B H,Khalil D A,Hollis B W.Ipriflavone,a synthetic phytoestrogen,enhances intestinal calcium transport in vitro[J].Calcif Tissue Int,2000,67（3）:225-229.

[7]Peng S,Xia R,Fang H,et al.Effect of epimedium-derived phy?toestrogen on bone turnover and bone microarchitecture in OVX-induced osteoporotic rats[J].J Huazhong Univ Sci Techno?log Med Sci,2008,28（2）:167-170.

[8]Mathey J,Mardon J,Fokialakis N,et al.Modulation of soy isofla?vones bioavailability and subsequent effects in bone health in ovariectomized rats:the case for equol[J].Osteoporos Int,2007,18（5）:671-679.

[9]Tanaka M,Mori H,Kayasuga R,et al.Long-term minodronic acid（ONO-5920/YM529）treatment suppresses increased bone turn?over,plus prevents reduction in bone mass and bone strength in ovariectomized rats with establishec osteopenia[J].Bone,2008,43（5）:894-900.

[10]Saitoh S,Sato T,Harada H,et al.Biotransformation of soy isofla?vone-glycosides in laying hens:intestinal absorption and preferen?tial accumulation into egg yolk of equol,a more estrogenic metabo?lite of daidzein[J].Biochim Biophys Acta,2004,1674（2）:122-130.

[11]馬文強(qiáng).沙棘的生物學(xué)功能及其在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用前景[J].飼料與畜牧,2007（10）:43-45.

[12]皮雄娥,費(fèi)笛波,王龍英,等.大豆黃酮及其生理功能的研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè),2005,26（4）:11-14.

[13]艾曉杰,吳曉林,朱勇琪,等.大豆黃酮對(duì)荷斯坦牛乳中蛋白質(zhì)和脂肪含量的影響[J].中國(guó)奶牛,2005（6）:23-25.

[14]陶勝宏,韓正康,王國(guó)杰.伊普異黃酮對(duì)不同生長(zhǎng)階段肉雞生長(zhǎng)性能和有關(guān)血清生化指標(biāo)的影響[J].畜牧與獸醫(yī),2007,39（2）:18-21.

[15]劉紅南,李垚,趙偉,等.沙棘葉總黃酮對(duì)1～21日齡愛(ài)拔益加肉雞蛋白質(zhì)利用率的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,22（4）:1024-1030.

[16]李垚,付晶,王寶東,等.沙棘黃酮對(duì)AA肉仔雞胴體和肉品質(zhì)的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39（9）:1217-1223.

[17]朱建平,戴林坤,伯紹軍,等.大豆黃酮對(duì)櫻桃谷肉種鴨生產(chǎn)性能的影響[J].飼料工業(yè),2002,23（1）:34-35.

[18]王利華,王光,代菁,等.大豆異黃酮對(duì)肉雞生產(chǎn)性能和胴體品質(zhì)的影響[J].飼料工業(yè),2006,27（3）:30-31.

[19]劉燕強(qiáng),韓正康.異黃酮植物雌激素——大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能及其血液中幾種激素水平的影響[J].中國(guó)畜牧雜志,1998,34（3）:9-10.

[20]邵淑麗,徐興軍,趙軍,等.沙棘嫩枝葉對(duì)雞日糧中蛋白質(zhì)利用率的影響[J].高師理科學(xué)刊,2001,21（2）:47-49.

[21]侯宗梅.日糧中添加異黃酮植物雌激素對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能和甲狀腺激素的影響[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[22]馬海田.異黃酮植物雌激素對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)及其吸收機(jī)理的研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[23]陳杰,楊國(guó)宇,韓正康.大豆黃酮對(duì)反芻動(dòng)物血清睪酮和瘤胃消化代謝的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)研究,1999,20（2）:17-19.

[24]郝振榮,朱志寧,王明,等.大豆異黃酮對(duì)奶牛泌乳后期泌乳性能、免疫功能和乳腺肥大細(xì)胞白介素-4水平的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,22（6）:1679-1686.

[25]Sakai T,Furoku S,Nakamoto M,et al.The soy isoflavone equol enhances antigen-specific IgE pProduction in ovalbumin-immu?nized BALB/c mice[J].Journal of Nutritional Science Vitaminolo?gy,2010,56（1）:72-76.

[26]鄭元林,楊敏,毛縝,等.大豆黃酮在D半乳糖至衰老小鼠肝組織氧化損傷中的保護(hù)作用[J].徐州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2008,12（4）:1-7.

[27]林成招,馬海田,鄒思湘,等.大豆異黃酮對(duì)大鼠小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)及葡萄糖和氨基酸吸收的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,28（1）:71-75.