張 攀 綜述 葉朝陽 審校

目前維持性血液透析(HD)患者使用的血管通路主要是動靜脈內(nèi)瘺(AVF)、移植血管和帶滌綸套中心靜脈導(dǎo)管。主流觀點(diǎn)認(rèn)為AVF首選[1]，移植血管其次[2]，最后考慮靜脈導(dǎo)管[3]。K-DOQ指南認(rèn)為移植血管只用于自體AVF不能成熟、內(nèi)瘺閉塞或者血管解剖條件不適合做內(nèi)瘺的患者。移植血管的來源一般為患者自體血管、尸體血管、異種(動物)血管及人造血管。最好的移植血管是患者自體血管，一般是大隱靜脈[4]。脫細(xì)胞牛頸靜脈和人尸血管易發(fā)生血栓、動脈瘤及鈣化，在臨床上未廣泛接受[5-7]。聚四氟乙烯(PTFE)人造血管多用于口徑>6 mm的HD患者的移植血管通路。研究表明PTFE人造血管在一、二級通暢率，感染風(fēng)險及住院風(fēng)險上均次于自體AVF，但好于靜脈導(dǎo)管[2]。盡管PTFE人造血管使用廣泛，但相對于自體移植血管仍然存在明顯不足[8,9]，易發(fā)生感染、血栓、內(nèi)膜增生、流出道或吻合口閉塞等[4,10]，平均通暢時間僅10月左右。此外，人工材料生物兼容性較差，不利細(xì)胞的正常生物行為[11]，也易造成移植性炎癥反應(yīng)[12]。

組織工程是一種應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理,將人體某部分的組織細(xì)胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進(jìn)行人工培養(yǎng)繁殖,擴(kuò)增,然后移植至人體內(nèi)所需要部位,從而達(dá)到器官修復(fù)或再造的治療目的的技術(shù)。隨著組織工程技術(shù)的進(jìn)步，組織工程血管(tissue-engineered blood vascular，TEBV)越來越多地應(yīng)用于臨床。Shin’oka等[13,14]率先應(yīng)用自體骨髓干細(xì)胞-高分子材料種植技術(shù)構(gòu)建組織血管，并成功用于壓力較低的兒童患者肺動脈流出道的修復(fù)。然而這種方法構(gòu)建的血管不具備足夠的機(jī)械強(qiáng)度，不能用于成人的動脈搭橋。其他用類似方法構(gòu)建的血管也未能獲得足夠應(yīng)用于臨床的抗壓強(qiáng)度[15,16]。要將TEBV用于制作透析血管通路，必須要使構(gòu)建的血管獲得足夠的機(jī)械強(qiáng)度與生物兼容性。為此，國外的專家已經(jīng)進(jìn)行了初步的嘗試并取得了令人鼓舞的成果。

分層構(gòu)建法構(gòu)建的TEBV

分層構(gòu)建法與簡化分層構(gòu)建法1998年出現(xiàn)的分層構(gòu)建法，可獲得具有足夠機(jī)械強(qiáng)度的TEBV。L’Heureux等[17]采用三種血管細(xì)胞預(yù)先培養(yǎng)再組合形成具板層結(jié)構(gòu)類天然血管的純生物材料。他們先分別培養(yǎng)人臍靜脈平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)和人皮膚成纖維母細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)B)于培養(yǎng)瓶，用條件化培養(yǎng)液培育30d后，形成由細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)構(gòu)成的膜片狀培養(yǎng)物。將FB膜片從瓶壁上剝離，包裹在惰性管軸外繼續(xù)培養(yǎng)，在成熟期膜片相互緊密黏合，產(chǎn)生圓柱狀培養(yǎng)物。FB管膜經(jīng)脫水處理制成無細(xì)胞的內(nèi)膜。組裝時，(1)將內(nèi)膜套在PTFE多孔管軸外，軸外徑3 mm，再裹上SMC膜片，制作血管中膜，此時將構(gòu)建物置于生物反應(yīng)器，培養(yǎng)液同時通過管腔和管外回流，支持管壁細(xì)胞生長；(2)裹上FB膜作為外膜，待管壁細(xì)胞和ECM培育成熟；(3)脫去中心管軸，管內(nèi)接種內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，EC)總時程3月培育出了具有活性細(xì)胞的，并且類似機(jī)體血管板層結(jié)構(gòu)的TEBV。該血管壁SMC和EC都表現(xiàn)出分化狀態(tài)，血液相容性好，能耐受2 000 mmHg的靜水壓，動物體內(nèi)短期移植(7d)顯示易于手術(shù)操作,縫合性良好。這種TEBV制成，是血管組織工程領(lǐng)域一大突破，顯示了通過細(xì)胞成分培養(yǎng)構(gòu)筑功能性血管的可能性。

此后，Peck等[18]對上述分層構(gòu)建法進(jìn)行了簡化，以成纖維母細(xì)胞為種子，培養(yǎng)8周形成生物膜后，包繞在有PTFE涂層的不銹鋼軸上繼續(xù)培養(yǎng)10周，使其形成管狀膠原支架。此方法的特點(diǎn)是取消了中層的SMC，其優(yōu)勢在于減少血管培養(yǎng)所需的細(xì)胞類型，進(jìn)而減少培養(yǎng)細(xì)胞所需要的培養(yǎng)條件和附加質(zhì)量控制措施。雖然在自體血管中SMC層的收縮功能在血壓控制中發(fā)揮著重要的作用，但對移植血管的通暢性并無明顯影響。此外，血清培養(yǎng)的SMC細(xì)胞具有高增生性，取消中層的SMC也就避免了內(nèi)膜增生的風(fēng)險[19]。

簡化分層構(gòu)建血管在動物模型上的研究2006年L’Heureux等[20]一系列成功的動物實(shí)驗(yàn)證明了這種簡化的TEBV的有效性,被命名為“LifelineTMgrafts”，構(gòu)建血管的細(xì)胞取自56～79歲的血管搭橋術(shù)患者，動物模型有犬、裸鼠及恒河猴。免疫抑制犬模型(4例)為14d短期評估，組織學(xué)顯示存在巨大免疫反應(yīng)。裸鼠模型實(shí)驗(yàn)分兩組，第一組(13例)使用的是單層的1.5 mm內(nèi)徑血管(無內(nèi)膜)，被移植到動物的腹主動脈上，225d后總通暢率85%，但觀察到血管內(nèi)徑增加，提示血管強(qiáng)度需進(jìn)一步加強(qiáng)。第二組(14例)使用的是包含內(nèi)膜的雙層血管[9個片段，平均抗壓強(qiáng)度(3 688±1 865)mmHg]，225d后總通暢率86%。與第一組不同的是血管口徑保持穩(wěn)定，顯示該血管有足夠的機(jī)械強(qiáng)度。鏡下顯示血管與周圍組織融合良好，組織學(xué)評估證實(shí)血管與自體組織完全融合。長期移植未出現(xiàn)血栓，說明在術(shù)后無抗血小板治療的情況下，此種血管具有良好的抗血栓能力。此外，第180天血管腔內(nèi)未見內(nèi)皮細(xì)胞定殖，從側(cè)面說明管腔內(nèi)未種植內(nèi)皮細(xì)胞的移植血管是可以保持通暢的。血管成熟性方面：第90天可見中層存在稀薄的α肌動蛋白陽性的SMC及內(nèi)膜有融合的內(nèi)皮細(xì)胞。Movat染色，“中層”含有清晰的彈性薄層及大量粘多糖。第180天，中層厚度無改變，彈性層密度增加，黏多糖不可見。這些變化提示血管達(dá)到成熟與重建過程的平衡。此過程中殘存的可溶性膠原支架在數(shù)周內(nèi)完全降解[21]。為了進(jìn)一步對該移植血管進(jìn)行臨床相關(guān)性及生化環(huán)境的評估，學(xué)者們采用了免疫抑制靈長目模型恒河猴3只[內(nèi)徑4.2 mm，5個片段，平均抗壓強(qiáng)度(3 468±500)mmHg]，1例移植于髂動脈，2例移植于腹主動脈。盡管是異種血管移植，存在輕微的免疫反應(yīng)，6～8周后所有移植血管被取出，所有血管通暢，未見血管瘤或管腔狹窄，內(nèi)膜未見內(nèi)皮細(xì)胞增生。組織學(xué)分析顯示血管重建比裸鼠模型要輕，也許是因?yàn)橐浦矔r間較短或者采用了免疫抑制，也可能是兩種模型本質(zhì)上的差別。

LifelineTMTEBV作為HD通路的臨床研究2007年L’Heureux等[22]報道了6例首批接受LifelineTMTEBV移植的患者，參與患者均為終末期腎病，年齡29～89歲(68±17歲)，每周透析3次。所有患者均為PTFE移植血管失敗，該研究應(yīng)用LifelineTM血管作為動靜脈搭橋HD通路。所構(gòu)建TEBV長20～40 cm，都用于上臂血管通路。早期(3月內(nèi))血管通暢，患者未見不良反應(yīng)。生物機(jī)械測試顯示LifelineTMgrafts平均強(qiáng)度3 490±892 mmHg(230個片段,25例患者)，高于人大隱靜脈(1 599±877 mmHg,7個片段)，并具有可重復(fù)性[(3 238±366)mmHg、6個片段vs(3 561±435)mmHg、25個片段][23]。2009年McAllister等[24]的一項(xiàng)隊列研究共納入10例患者，9例成功接受上臂血管移植，1例因?yàn)橄莱鲅顺觥?例移植后39d死于無關(guān)病因，死亡時移植血管通暢。1例患者移植后第3天出現(xiàn)急性免疫反應(yīng)并出現(xiàn)血管瘤，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)血管的新型牛血清中IgG水平較高所致，因?yàn)槭褂萌gG的牛血清培養(yǎng)的血管的患者未發(fā)生免疫反應(yīng)。有3例前90d失敗，低于AVF預(yù)期[25,26]；余下5例保持通暢6～20月，總通暢時間為68個患者月；其中1例患者需要手術(shù)干預(yù)。總體初始通暢率(1月)78%(7/9)，半年通暢率60%(5/8)。通路事件率為0.7/患者年，優(yōu)于PTFE移植血管[27]。盡管此項(xiàng)研究說明TEBV臨床應(yīng)用于透析血管通路在理論與實(shí)踐上是可行的，但仍存在局限性：(1)病例數(shù)較少，需要更大樣本與更長時間的觀察；(2)造價高昂[28]，每根移植血管造價≥15 000美元，不太符合臨床移植血管的選擇標(biāo)準(zhǔn)；(3)患者單獨(dú)培養(yǎng)血管需要耗時6～9個月，不適用于需要緊急干預(yù)者。

脈動生物反應(yīng)器構(gòu)建TEBV

脈動生物反應(yīng)器構(gòu)建TEBV的方法Niklason等[29]將SMC懸液注入生物可降解聚合物材料聚乙醇酸(PGA)制成管形支架中，細(xì)胞貼壁后，用近似大哺乳動物胎兒發(fā)育環(huán)境，產(chǎn)生脈動流和環(huán)流的生物模擬培養(yǎng)系統(tǒng)培育。培育8周中，SMC遷入PGA骨架內(nèi)，其在PGA降解的同時，分泌膠原等ECM。當(dāng)ECM與細(xì)胞一起形成的腎小管結(jié)構(gòu)替代PGA支架時，管腔內(nèi)接種EC生物模擬培養(yǎng)系統(tǒng)使培養(yǎng)液在管腔中不斷流動(產(chǎn)生一定的剪切力)，并通過脈沖泵的控制使流體產(chǎn)生有節(jié)律的脈動波以刺激細(xì)胞成熟。該實(shí)驗(yàn)顯示，脈動培養(yǎng)條件利于SMC遷移、分化表型表達(dá)(細(xì)胞內(nèi)肌球蛋白量增多，細(xì)胞保持收縮反應(yīng)，細(xì)胞有絲分裂率無增大)及細(xì)胞分泌膠原/ECM。體外培養(yǎng)可達(dá)到近似體內(nèi)的細(xì)胞密度及膠原含量。在此種物理力學(xué)環(huán)境和優(yōu)化培養(yǎng)渣中培養(yǎng)出的血管，其機(jī)械力學(xué)性能優(yōu)于先前任何一種TEBV，抗脹裂強(qiáng)度/靜水壓大于2 000 mmHg，縫合固持強(qiáng)度達(dá)90g，膠原含量超過50%。管壁細(xì)胞具有良好的分化狀態(tài)，更新率低。血管對藥物作用產(chǎn)生收縮反應(yīng)。動物自體移植4周，TEBV仍通暢，血液流動良好，異體移植通暢性大于無脈動培養(yǎng)。組織學(xué)檢查，血管無炎癥反應(yīng)。這一模式首創(chuàng)脈動培養(yǎng)，革新了體外TEBV培育條件。

生物反應(yīng)器構(gòu)建組織工程化血管的動物模型研究2011年，Dahl等[30]采用此構(gòu)建法，以人尸體來源SMC為種子細(xì)胞，構(gòu)建口徑3～6 mm的TEBV。得到的膠原纖維基質(zhì)無需內(nèi)皮細(xì)胞化，經(jīng)干燥滅活及去抗原性后在狒狒模型上作為動靜脈搭橋(內(nèi)徑6 mm 頸動脈-肱靜脈)，共手術(shù)9例，1例因傷口感染退出，余下8例中有1例術(shù)后3月出現(xiàn)栓塞，考慮可能為技術(shù)失敗。觀察6月通暢率為88%(7/8)，未見動脈瘤、血管鈣化及內(nèi)膜增生。異種移植未出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，具有良好的生物兼容性及免疫耐受性。檢測該血管伸展強(qiáng)度(178±11)g，最大抗靜水壓強(qiáng)度(3 337±343)mmHg，高于大隱靜脈。該血管還可存儲于PBS液中4℃可保存12月及以上。

生物反應(yīng)器構(gòu)建的TEBV有希望應(yīng)用于HD通路的制作盡管生物反應(yīng)器構(gòu)建TEBV還未進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但其具有的某些特點(diǎn)，有望成功用于制作HD通路:(1)有足夠的機(jī)械穩(wěn)定性，可事先確定管徑大小，且無分支，優(yōu)于尸體血管。(2)用于制作血管通路時，不必要在管腔內(nèi)種植內(nèi)皮細(xì)胞(內(nèi)皮化)。因?yàn)檠和肝鲅芡返目趶揭话?5 mm，血流量>500 ml/min，這種條件下省去內(nèi)皮化不會增加凝血的風(fēng)險，同時能有效降低成本，節(jié)省了寶貴的手術(shù)時間。如需要用于冠脈搭橋(口徑<3 mm)，為減小血管狹窄的風(fēng)險，也可在已構(gòu)建好的血管基礎(chǔ)上再種植內(nèi)皮細(xì)胞[24，31]，其來源為脂肪組織[32]或外周血[33，34],方便快速，患者只需等待數(shù)周乃至數(shù)天。(3)使用異體SMC構(gòu)建血管可不必對每例患者單獨(dú)進(jìn)行血管構(gòu)建，能大量生產(chǎn)進(jìn)而商業(yè)化，利于急診應(yīng)用。(4)這種血管的主要成分是滅活的脫細(xì)胞基質(zhì)，因此可以長時間存儲，簡化運(yùn)輸條件及省去一些質(zhì)量控制手續(xù)。

小結(jié)：化學(xué)材料被組織工程材料取代是醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個趨勢[35]。我國透析人群總數(shù)在逐年擴(kuò)大，高齡透析患者比例上升，透析時間的延長，對HD血管通路的建立和維護(hù)提出了巨大的挑戰(zhàn)。對于血管條件不好的患者，采用移植TEBV建立血管通路應(yīng)該是可行的，而且是必要的。組織工程作為一門新興的交叉學(xué)科，如何更好的服務(wù)于臨床，服務(wù)于患者，是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的基本要求，也是醫(yī)療臨床、基礎(chǔ)工作者共同努力的方向。

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