王建華，王衛(wèi)國，錢亞東，張紅安

(阜陽市人民醫(yī)院，安徽 阜陽 236006)

初培養(yǎng)結(jié)合PCR檢測精液解脲脲原體感染的臨床應用

王建華，王衛(wèi)國，錢亞東，張紅安

(阜陽市人民醫(yī)院，安徽 阜陽 236006)

目的探討初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR方法檢測精液解脲脲原體感染應用價值。方法選取120例不育癥患者的精液，分別用PCR、培養(yǎng)加藥敏試劑盒、初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR的方法檢測解脲脲原體，并與分離培養(yǎng)結(jié)果相比較。結(jié)果120例精液分離培養(yǎng)出62例解脲脲原體，使用PCR法檢測出30例陽性、用培養(yǎng)加藥敏試劑盒檢測出65例陽性、用初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR技術(shù)檢測出62例陽性，以上三種方法與分離培養(yǎng)結(jié)果的總符合率分別為73.3%、97.5%和100%。結(jié)論初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR是一種檢測精液解脲脲原體的可行性方法。

解脲脲原體；PCR；培養(yǎng)；精液

解脲脲原體是是人類泌尿生殖道最常見的寄生菌之一，可以引起多種疾病，若上行感染引起男性前列腺炎或附睪炎，可導致不育癥的發(fā)生[1，2]。目前檢測生殖道解脲脲原體的方法基本上采用PCR或培養(yǎng)加藥敏試劑盒，由于精液相對于其他生殖道標本，較為特殊，目前這兩種被廣泛采用的方法對于檢測精液中解脲脲原體是否合適，相關(guān)報道極為少見。為此，我們通過PCR、培養(yǎng)加藥敏試劑盒以及初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR方法檢測精液中解脲脲原體，并與分離培養(yǎng)結(jié)果(當前實驗室檢測解脲脲原體的“金標準”)相比較，分析何種方法更適合檢測精液中的解脲脲原體。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2011年5月至2011年7月就診于阜陽市人民醫(yī)院生殖科的120例男性不育患者精液，年齡18～47歲，所選對象無梅毒、淋病、尖銳濕疣、生殖器皰疹，無細菌性尿路感染，無衣原體和人型支原體感染，無艾滋病毒感染。所選患者在檢測前禁欲5d，標本采集前排空尿液，消毒外尿道口，收集所有的精液于無菌的容器中，立即送檢。

1.2 試劑和儀器 PPLO培養(yǎng)基(上海博華生物科技有限公司)，馬血清(廣州蕊特生物科技有限公司)，解脲脲原體熒光定量PCR試劑盒(廣州達安公司)，生殖道支原體培養(yǎng)和藥敏檢測試劑盒(鄭州安圖生物有限公司)，瑞姬染液(廣州偉伯化工有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 PCR直接檢測 取充分混勻精液100 μl，加入無菌生理鹽水1 ml洗滌2次，15 000r/min離心10 min，留取沉淀物，加入100 μl的DNA提取液，100℃加熱10min，取上清2μl作為PCR檢測模板，熒光定量PCR檢測按檢測說明書進行。

1.3.2 培養(yǎng)加藥敏試劑盒檢測 加入100 μl培養(yǎng)液于陰性對照孔后，加入100μl精液于培養(yǎng)液內(nèi)，混勻后用100μl移液器分別加入各培養(yǎng)孔，液體石蠟封閉；剩余培養(yǎng)液勿棄，加入液體石蠟后蓋緊瓶蓋同培養(yǎng)板相同條件培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果，。各培養(yǎng)孔不變色為陰性，對照孔和鑒定孔變?yōu)榧t色而計數(shù)孔沒有變色，表明感染量小于104CCU/ml，若對照孔、鑒定孔及計數(shù)孔都變紅色，表明感染量≥104CCU/ml。

1.3.3 初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR檢測 取方法(1.3.2)的培養(yǎng)產(chǎn)物100 μl，15 000r/min離心沉淀，無菌生理鹽水洗滌2次，留取沉淀物，提取DNA，熒光定量PCR檢測按檢測說明書進行。

1.3.4 解脲脲原體分離培養(yǎng) 取100 μl精液加入到以PPLO肉湯(內(nèi)配有馬血清、酵母浸液、尿素等)中，5%CO2、37℃培養(yǎng)24～48h，觀察培養(yǎng)液顏色變化，由黃色變成紅色時，即判為陽性。陽性樣本轉(zhuǎn)種于新的液體培養(yǎng)基和相應的固體培養(yǎng)基上，置于微厭氧環(huán)境中作次代培養(yǎng)，以放大鏡觀察菌落形態(tài)，同時將液體培養(yǎng)物離心后涂片，作姬姆薩染色。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.0軟件，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

所選120份精液樣本，有62例分離培養(yǎng)出解脲脲原體，用PCR直接檢測標本，共檢測出30例陽性，與培養(yǎng)分離結(jié)果比較，陽性符合率48.4%，陰性符合率為100.0%，總符合率為73.3%，用培養(yǎng)加藥敏試劑盒檢測出65例陽性，與培養(yǎng)分離結(jié)果比較，陽性符合率100%，陰性符合率為94.8%，總符合率為97.5%，用初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR檢測出62例陽性，與培養(yǎng)結(jié)果比較，陽性符合率、陰性符合率、總符合率均為100%。培養(yǎng)加藥敏試劑盒方法與初培養(yǎng)結(jié)合PCR法檢測解脲脲原體的陽性率差異無統(tǒng)計學意義，但明顯高于PCR直接檢測的結(jié)果(P＜0.05)。

3 討論

解脲脲原體是人類泌尿生殖道最常見的微生物之一，正常情況下，與宿主共存，不表現(xiàn)感染癥狀，但在特定的條件下可以引起機會性感染。解脲脲原體感染后，可產(chǎn)生侵襲性酶如磷脂酶等，破壞宿主細胞膜上的磷脂，阻礙宿主細胞的生物合成，也可產(chǎn)生尿素酶，生成代謝產(chǎn)物氨，直接對宿主細胞產(chǎn)生毒性作用，同時產(chǎn)生IgA蛋白酶，破壞泌尿生殖道黏膜局部的抗感染能力，由此導致泌尿生殖道感染性疾病的發(fā)生。解脲脲原體感染可以引起睪丸附睪炎、慢性前列腺炎，由于解脲脲原體可吸附于精子表面，阻礙精子運動，產(chǎn)生的神經(jīng)氨酸酶樣物質(zhì)干擾受精過程，而且其與精子存在共同抗原，引起機體對精子的交叉反應，造成免疫損傷，故解脲脲原體感染是男性不育癥的常見原因之一[2，3]。

由于精液相對于其他標本如泌尿生殖道分泌物、中段尿，較為特殊，一方面精液成分非常復雜，對檢測方法的干擾因素多，另一方面留取精液的過程較為繁瑣，標本極易受到污染，會導致檢測的假陽性結(jié)果。當前對解脲脲原體檢測的常用方法是PCR、培養(yǎng)加藥敏試劑盒，這兩種方法對檢測精液解脲脲原體的適用性，報道較少。本實驗發(fā)現(xiàn)，用PCR直接檢測精液解脲脲原體，與分離培養(yǎng)結(jié)果比較，陽性符合率僅為48.4%，說明此法的靈敏度不夠。由于精液中存在黏蛋白、免疫球蛋白、蛋白酶、脂類和多糖等物質(zhì)，這些物質(zhì)均是PCR反應抑制物，而且煮沸法提取精液DNA時，并不一定能使DNA與結(jié)合蛋白完全分離，這些物質(zhì)還可能對DNA產(chǎn)生物理包裹作用，不能使其與DNA聚合酶接觸，導致PCR擴增檢測的靈敏度降低，雖然在檢測過程中對精液的洗滌可以部分減少PCR抑制物，但也很有可能造成解脲脲原體的丟失，所以造成PCR直接檢測精液中解脲脲原體的靈敏度不足。我們用培養(yǎng)加藥敏試劑盒檢測時發(fā)現(xiàn)，有3例標本產(chǎn)生假陽性，說明此法的特異性不很理想，由于這種類型的試劑盒，均利用解脲脲原體分解精氨酸或尿素使培養(yǎng)基發(fā)生顏色變化，來判斷其生長與否，由于精液在留取過程中條件難以控制，標本很可能受到細菌污染，而且非淋球菌性泌尿生殖道感染大部分都是混合感染，雖然培養(yǎng)基中加入了青霉素、醋酸鉈等抗生素，破壞細菌的細胞壁防止雜菌生長，但不能抑制革蘭陰性菌增殖，并且當前微生物對抗生素的抗性越來越強[4-7]，很有可能造成假陽性結(jié)果。本實驗利用初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR的方式檢測精液中解脲脲原體，與培養(yǎng)分離結(jié)果相比，完全符合，由于經(jīng)過初培養(yǎng)和洗滌后，PCR抑制物會急劇減少，同時利用PCR檢測的特異性對培養(yǎng)物再次鑒定，整個方案簡單易行。

本實驗證明，PCR技術(shù)直接檢測精液中的解脲脲原體并不合適，而當前使用最為廣泛的培養(yǎng)加藥敏試劑盒，雖然靈敏度很好，但有一定的假陽性，對臨床診斷可能會造成一定的誤導[6]，培養(yǎng)分離的方法操作復雜，條件要求高，并不適用于臨床實驗室，以前使用的血清學方法已被證明意義不大，而本實驗所采用的初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR方法能較好解決精液解脲脲原體感染的診斷，簡單易行，值得臨床應用。

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Initial culture binding PCR assay for the detection of infection of Ureaplasma urealyticum in semen

WANG Jianhua,WANG Weiguo,QIAN Yadong,et al.Department of Clinical Laboratory,The People's Hospital of Fuyang,Anhui Fuyang 236006,China.

ObjectiveTo explore the applied value of using initial culture binding polymerase chain reaction(PCR)assay for the detection of infection of Ureaplasma urealyticum in semen.MethodsThe semen samples were collected from 120 sufferers with sterility,Ureaplasma urealyticum were detected by 3 methods:PCR,culture,initial culture binding PCR,respectively,and the results were anglyzed.ResultsOf the 120 samples,Ureaplasma urealyticum were isolated in 62 cases by isolation and culture,positive in 30 cases by PCR,positive in 65 cases by culture and drug susceptibility kit,and positive in 62 cases by initial culture binding PCR.Compared with isolating culture method,the coincidence was 73.3%,97.5%and 100%respectively.Conclusion Initial culture binding PCR is a kind of feasible means to detect Ureaplasma urealyticum in semen.

Ureaplasma urealyticum;Polymerase chain reaction;Culture;Semen

R446.5,R375+.3

B

1674-1129(2012)04-0361-03

王衛(wèi)國

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.017