陶文沂，倪海晴

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

發(fā)酵溫度與酶活性、醬油風(fēng)味物質(zhì)組成均有一定的內(nèi)在關(guān)系。日本高鹽稀態(tài)發(fā)酵的起始溫度為10℃～15℃，發(fā)酵一定時(shí)間后調(diào)至20℃～25℃，最后升至30℃～35℃。產(chǎn)出的醬油醬香醇厚、酯香濃郁。由于發(fā)酵起始溫度低，適宜低溫環(huán)境的各種微生物和酶類都可能發(fā)揮作用，多種物質(zhì)得到充分發(fā)酵，但是溫度低導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間長，加大產(chǎn)品成本，與我國廣大百姓消費(fèi)水平不相適應(yīng)。我國低鹽固態(tài)發(fā)酵的品溫在40℃～45℃，有利于提高原料利用率，周期短、成本低，但醬油香氣的形成會(huì)受到一定的影響。筆者希望通過發(fā)酵溫度與酶活性、醬油風(fēng)味物質(zhì)組成內(nèi)在關(guān)系的探索，結(jié)合兩者的工藝，合理調(diào)整發(fā)酵溫度和鹽水含量，改善我國低鹽固態(tài)發(fā)酵香氣不足的現(xiàn)狀。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種來源：米曲霉3.042：本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

原材料：麩皮、豆粕、馬鈴薯均為市售，購于無錫市小三里橋糧油市場。

主要試劑：3，5-二硝基水楊酸，吐溫80，L-酪氨酸來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳酸來自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；無水碳酸鈉來自上海虹光化工廠。

主要儀器與設(shè)備：SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，752型紫外分光光度計(jì)，超凈無菌操作臺(tái)，81-2型磁力恒溫?cái)嚢杵?，YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸氣滅菌鍋，迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜等均為國產(chǎn)；液相色譜儀（Ag1100）：美國安捷倫公司；高速離心機(jī)HITACHI CR22G：日本日立公司；光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司；2300自動(dòng)定氮儀：FOSS-TECATOR。

培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）；種曲培養(yǎng)基：麩皮20g，水19mL，拌勻后裝于250mL三角瓶中，0.1MPa滅菌20min；大曲培養(yǎng)基：麩皮16g，豆粕24g，水32mL，拌勻后裝于500mL三角瓶中，0.1MPa滅菌20min；酵母菌培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L。

主要試劑的配制。

（1）緩沖液：乳酸-乳酸鈉緩沖液（pH 3.0）：稱取80%～90%乳酸10.6g，定容至1000mL為A液；稱取70%乳酸鈉16g，定容至1000mL為B液；取A液8mL、B液1mL混合，用蒸餾水稀釋1倍，即成0.05mol/L乳酸-乳酸鈉緩沖液。

磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）：稱取NaH2PO431.2g，定容至1000mL成0.2mol/LA液；稱取Na2HPO471.63g，定容至1000mL成0.2mol/L B液；取A液28mL、B液72mL混合，用蒸餾水稀釋1倍，即成0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）。

醋酸鈉緩沖液（pH 4.6）：稱取醋酸鈉6.7g、冰醋酸2.6mL，蒸餾水溶解定容至1000mL。

上述緩沖液應(yīng)以酸度計(jì)或精密試紙矯正pH值。

（2）2%酪蛋白溶液：中性酪蛋白溶液：稱取干酪素2g，加入0.1 mol/L NaOH溶液10mL，小火加熱煮沸使之溶解，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）定容至100mL。配置后應(yīng)及時(shí)使用或冰箱保存。

2%酸性酪蛋白溶液：稱取干酪素2g，加入1mL濃乳酸加速其溶解，然后加入少量乳酸-乳酸鈉緩沖液（pH3.0），小火加熱煮沸使之溶解，用乳酸-乳酸鈉緩沖液（pH 3.0）定容至100mL，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）福林試劑：于2000 mL回流裝置內(nèi)，加入鎢酸鈉100g、鉬酸鈉25g、蒸餾水700mL、85%磷酸50mL、濃鹽酸100mL，文火回流10h。加入硫酸鋰50g，蒸餾水50mL，混勻后，加入幾滴液溴，再煮沸15min驅(qū)逐殘溴，并除去顏色，溶液應(yīng)該呈黃色而不是綠色。若溶液仍有綠色，需再加幾滴溴液，再煮沸除去之。待冷卻后，定容至1000mL，過濾后置于棕色瓶中4℃冰箱保存，此溶液加2倍蒸餾水稀釋即成稀釋的福林試劑。

（4）DNS試劑：精確稱取6.3g DNS（3，5-二硝基水楊酸）溶于262mL 2mol/L NaOH溶液中，然后加入酒石酸鉀鈉熱溶液中（182.0g酒石酸鉀鈉溶于500mL水）。再加入5.0g苯酚和5.0g亞硫酸鈉，加熱攪拌至溶解，冷卻后定容至1000mL，貯于棕色試劑瓶中4℃冰箱保存。

（5）1%可溶性淀粉：精確稱取1.000g可溶性淀粉（以絕干計(jì)），加入醋酸鈉緩沖液（pH 4.6），加熱煮沸至透明，冷卻后用醋酸鈉緩沖液定容至100mL，此溶液需當(dāng)天配制。

（6）0.4mol/L三氯乙酸（TCA）溶液：稱取65.4g TCA，蒸餾水溶解定容至1000mL。

（7）6%苯酚：將苯酚加熱溶解，冷卻后準(zhǔn)確稱取6g苯酚，蒸餾水溶解定容至100mL。

（8）0.4mol/L碳酸鈉溶液：稱取無水碳酸鈉42.4g，蒸餾水溶解定容至1000mL。

1.2 低鹽固態(tài)發(fā)酵方法

1）制備孢子懸浮液：取一支試管斜面菌種，加入含0.1%吐溫80作潤濕劑的無菌生理鹽水10mL，洗下孢子后倒入裝有玻璃珠的100mL無菌三角瓶中，振蕩器振蕩30min后用砂芯漏斗過濾，調(diào)整孢子濃度為107個(gè)/mL。

2）制種曲：接種上述孢子懸浮液1mL于種曲培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)72 h。

3）制大曲：大曲培養(yǎng)基滅菌后接入種曲，接種量為0.3%，攪拌均勻后，30℃培養(yǎng)48 h，即為發(fā)酵用大曲。

4）發(fā)酵：配制15%的鹽水，按大曲:鹽水=1:1.7加入鹽水，攪拌均勻后于45℃水浴鍋中發(fā)酵；48h后攪拌一次，然后加上保鮮膜密封發(fā)酵。

1.3 酶活的測定方法

1）含水量測定：取烘至恒重的培養(yǎng)皿，稱取10g曲料后稱得培養(yǎng)皿和曲料總重量為m1，105℃烘4.5h后稱得總重量為m2，含水量

2）粗酶液制取方法：稱取成曲5g，加入100mL蒸餾水，置于40℃水浴鍋中浸提1h，間歇攪拌，用濾紙過濾得粗酶液。

3）蛋白酶測定方法：采用福林酚法。

蛋白酶活力單位定義：在40℃每分鐘水解干酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

蛋白酶活性測定：試管中加入已稀釋的粗酶液樣品1mL，于40℃水浴鍋中預(yù)熱2min，加入同樣預(yù)熱的酪蛋白溶液1mL，精確保溫10min后立即加入0.4mol/L三氯乙酸2mL終止反應(yīng)，40℃水浴中保溫20min使殘余蛋白質(zhì)沉淀。離心，取上清液1mL加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5mL，福林試劑1mL，搖勻，40℃水浴保溫發(fā)色20min，于波長660nm處測其吸光度值?？瞻自囼?yàn)方法同上，在加酪蛋白溶液之前先加0.4mol/L三氯乙酸2mL使酶失活后，再加入酪蛋白溶液。

測定酸性蛋白酶活性時(shí)，把稀釋粗酶液和制備酪蛋白溶液用的緩沖液換成相應(yīng)的緩沖液即可。中性蛋白酶測定時(shí)使用磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2）；酸性蛋白酶測定時(shí)使用乳酸-乳酸鈉緩沖溶液（pH 3.0）。

蛋白酶活力計(jì)算公式：

式中：A為由粗酶液樣品測得的OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的酪氨酸微克數(shù)；4 為4mL 反應(yīng)液取出1mL 測定；n為粗酶液稀釋倍數(shù)；10 為酶反應(yīng)10min；ω 為樣品中含水量。

在試驗(yàn)示范的跟蹤過程中，云天化產(chǎn)品示范田的冬棗長勢旺盛，中期表現(xiàn)出掛果多，果實(shí)品相好，樹體健壯；采收期冬棗色澤好，果形均勻，畸形果少，口感佳。示范田畝增產(chǎn)82.4kg，畝增收10075.2元，給農(nóng)戶帶來的一定的經(jīng)濟(jì)效益。通過試驗(yàn)示范，云天化“滴灌二銨”和“大量元素水溶肥”系列肥料得到了種植戶的認(rèn)可。

4）糖化酶測定方法采用DNS法測定。

糖化酶活力單位定義：在40℃每分鐘水解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖的酶量，定義為1個(gè)糖化酶活力單位。

樣品測定：25mL比色管內(nèi)加入1%可溶性淀粉溶液1.0mL，40℃水浴鍋中預(yù)熱10min，加稀釋酶液1.0mL，40℃水浴中精確保溫5min后，立即加入DNS溶液2.0mL終止反應(yīng)，搖勻后沸水浴5min，冷卻后用蒸餾水定容至25mL，搖勻后，在波長540nm處測其吸光度值?？瞻自囼?yàn)方法同上，在加酶液之前先加DNS溶液2.0mL以鈍化酶活。

糖化酶活力計(jì)算公式為：

式中：A為由樣品測得OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得相當(dāng)?shù)钠咸烟呛量藬?shù)；n為酶液稀釋的倍數(shù)；5 為反應(yīng)5min；ω 為樣品中水分含量。

1.4 游離氨基酸分析

取醬油樣品1mL于25mL容量瓶中，用5%三氯乙酸溶液定容至25mL，沉淀2h后用雙層濾紙過濾，于10000r/min離心10min后取上清液測定游離氨基酸含量。

分析方法OPA、FMOC柱前衍生化。

色譜條件 色譜柱：（250×4.6）mm，5μm，ODS HYPERSIL；柱溫40℃；流速1.0mL/min；紫外檢測器338nm，262nm（Pro，Hypro）；洗脫方式：梯度洗脫。

1.5 醬醅分析

1）樣品處理精確稱取醬醅5.00g，放入150mL三角瓶中，加入70mL左右剛煮沸過的蒸餾水，浸泡0.5h，每隔10min攪拌一次。濾紙過濾，濾液移入100mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得5%濾液備用。

2）氨基酸態(tài)氮含量測定采用甲醛滴定法測定。

吸取上述5%濾液5mL放入250 mL燒杯中，加入蒸餾水60mL，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液電位滴定至pH值為8.2。然后，加入甲醛溶液10mL，混勻。再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH值為9.2，記下加入甲醛后消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)V2?？瞻自囼?yàn)方法同上，以5mL蒸餾水代替樣品稀釋液，記下空白試劑加入甲醛后消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)V1。

氨基酸態(tài)氮含量計(jì)算公式為：

式中：N為NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度；W為吸取5%醬油樣品的體積數(shù)，mL；0.014 為與1.00mL NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g。

氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定：采用鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定法。

3）總酸含量測定：吸取上述5%濾液5mL放入250mL燒杯中，加入蒸餾水60mL，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH值為8.2。記下醬油樣品滴定耗用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)V2?？瞻自囼?yàn)方法同上，以5mL蒸餾水代替樣品稀釋液，記下空白試劑滴定耗用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)V1。

總酸（以乳酸計(jì)）含量計(jì)算公式為：

式中：N為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度；W為吸取5%醬油樣品的體積數(shù)，mL；0.09 為與1.00mL 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)娜樗岬馁|(zhì)量，g。

4）總糖的測定：采用硫酸-苯酚法測定。將上述濾液稀釋所需倍數(shù)，吸取2mL于比色管中，加入6%苯酚1.0mL和濃硫酸5.0mL。靜置10min，搖勻后室溫放置20min。然后于波長490nm處測其吸光度值?？瞻自囼?yàn)方法同上，以2mL蒸餾水代替樣品稀釋液。

5）還原糖的測定：采用DNS法測定。將上述濾液稀釋所需倍數(shù)，吸取1mL于10mL比色管中，加入DNS試劑1mL，搖勻后置于沸水中精確保溫5min。取出冷卻后補(bǔ)加蒸餾水至10mL，搖勻后于波長540nm處測吸光度值。空白試驗(yàn)方法同上，以1mL蒸餾水代替樣品稀釋液。

6）總氮的測定：采用凱氏定氮法測定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 三階段溫度條件下溫度、鹽水濃度與酶活性、醬油風(fēng)味物質(zhì)組成關(guān)系的初步探索

嘗試采用發(fā)酵溫度前期25℃、15d；中期30℃、10d；后期45℃、5d。制醅時(shí)添加鹽水濃度為15%、21%、27%。同時(shí)以45℃、鹽水濃度為15%的低鹽固態(tài)發(fā)酵作為對照。跟蹤測定發(fā)酵過程中蛋白酶、糖化酶、氨態(tài)氮含量、總酸、總糖、還原糖含量變化。

在發(fā)酵過程中，前10d每天取樣，后20d每2d取一次樣，測定蛋白酶、糖化酶活性的變化規(guī)律，結(jié)果見圖1。

圖1 發(fā)酵過程中中性蛋白酶活性變化曲線Fig.1 Neutral protease activity change in soy sauce fermentation

由圖1可見，發(fā)酵前3d，盡管中性蛋白酶活力下降幅度都很大，但實(shí)驗(yàn)組酶活明顯比對照組高，對照組第3d酶活82.26U/g干基，實(shí)驗(yàn)組酶活在500.00U/g～800.00U/g干基以上。20d時(shí)對照組檢測不到酶活，而實(shí)驗(yàn)組在發(fā)酵結(jié)束時(shí)仍有酶活。

由圖2可見酸性蛋白酶變化情況，對照組的酸性蛋白酶活力在發(fā)酵前3d明顯下降，第7d就檢測不到活性。實(shí)驗(yàn)組的酸性蛋白酶酶活在整個(gè)發(fā)酵過程中緩慢下降，其中27%鹽濃度實(shí)驗(yàn)組第14d才沒有酶活，其他2個(gè)實(shí)驗(yàn)組的酶活力延長至第20d。

圖2 發(fā)酵過程中酸性蛋白酶活性變化曲線Fig.2 Acidic protease activity change in soy sauce fermentation

圖3 發(fā)酵過程中糖化酶活性變化曲線Fig.3 Gluco-amylase activity change in soy sauce fermentation

由圖3可見糖化酶變化情況，對照組的糖化酶活力在發(fā)酵前6d明顯下降，實(shí)驗(yàn)組的酶活在前5d也顯著下降，但下降幅度沒有對照組大。隨后，4組的糖化酶活力均緩慢下降，實(shí)驗(yàn)組的酶活力一直處于對照組的5倍以上。

由上可見，發(fā)酵溫度對于酶活力有很大的影響。溫度較低有利于酶活力的保存，對照組發(fā)酵溫度偏高易造成酶失去活性。糖化酶最適作用溫度較高，溫度影響相對較小。

對應(yīng)氨基酸態(tài)氮含量的變化可由圖4分析。對照組的氨基酸態(tài)氮含量呈逐漸上升趨勢；實(shí)驗(yàn)組在前期低溫階段氨基酸態(tài)氮含量增加有限。到第24d才由起始0.0333g/100mL增加為0.045g/100mL左右。在后期45℃發(fā)酵中增加較低溫階段明顯。在整個(gè)發(fā)酵過程中，對照組的氨基酸態(tài)氮含量較實(shí)驗(yàn)組高出很多，最終相差約37%～63%。由此可見，低溫雖然可以保持酶活較長時(shí)間，但低溫不是酶作用最適溫度，反應(yīng)速率低使酶水解產(chǎn)物量也低。溫度對于酶活、酶反應(yīng)速率的關(guān)系是辯證的，很好地確定三者關(guān)系，有利于醬油發(fā)酵。

由圖5、圖6可見，總糖和還原糖在發(fā)酵過程中總體呈上升趨勢，對照組的總糖和還原糖含量均較實(shí)驗(yàn)組高。20d時(shí)含量下降與發(fā)酵時(shí)美拉德反應(yīng)和酒精發(fā)酵消耗有關(guān)。

發(fā)酵得到的醬油主要質(zhì)量指標(biāo)比較見表1。

圖4 發(fā)酵過程中氨基態(tài)氮含量變化曲線Fig.4 Amino nitrogen content change in soy sauce fermentation

圖5 發(fā)酵過程中總糖含量變化曲線Fig5 Total sugar content change in soy sauce fermentation

圖6 發(fā)酵過程中還原糖含量變化曲線Fig.6 Reducing sugar content change in soy sauce fermentation

表1 實(shí)驗(yàn)組與對照組醬油質(zhì)量指標(biāo)比較Table 1 Comparison of indices of soy sauce between the experimental group and the blank group

由表1可知，實(shí)驗(yàn)組由于前期低溫發(fā)酵，與對照組相比，總氮、氨基酸態(tài)氮含量等都有所下降。但是，實(shí)驗(yàn)組的氨基酸態(tài)氮生成率卻高于對照組?？梢姡孩俚蜏匕l(fā)酵不利于酶反應(yīng)進(jìn)行，各項(xiàng)發(fā)酵產(chǎn)物含量均有所下降。②雖然實(shí)驗(yàn)組總氮含量不如對照組，原料利用率有所下降。但是實(shí)驗(yàn)組的氨基酸態(tài)氮生成率卻高于對照組，顯示，前期的低溫發(fā)酵有利于使總氮轉(zhuǎn)化為氨基酸態(tài)氮。

比較成品色澤外觀可見，實(shí)驗(yàn)組醬油成品顏色較淺，體態(tài)澄清，濃度適中，醬香味輕微；而對照組醬油成品顏色較深，呈棕褐色，體態(tài)澄清，濃度大，醬香濃郁。

進(jìn)一步對實(shí)驗(yàn)組與對照組醬油成品的游離氨基酸進(jìn)行測定，結(jié)果及比較見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對照組低鹽固態(tài)法發(fā)酵醬油游離氨基酸組成分析Table 2 Analysis of free amino acids composition in low-salt solidstate fermentation soy sauce between the experimental group and the control group

由表2可知，3組實(shí)驗(yàn)組的游離氨基酸總量都沒有對照組高。但15%鹽水含量的實(shí)驗(yàn)組的鮮味氨基酸含量為3.687mg/mL，較對照組3.223mg/mL高出14.39%，而苦味氨基酸較對照組降低35.23%；甜味和其他氨基酸也有所下降。其中，鮮味氨基酸的增加以及苦味氨基酸的減少可能是由于前期低溫發(fā)酵的影響，低溫發(fā)酵有利于適宜于低溫環(huán)境的各種酶類充分發(fā)揮作用，因此，有利于各種氨基酸的浸出。

2.2 兩階段溫度條件下溫度與酶活性、醬油風(fēng)味物質(zhì)組成關(guān)系探索

由上面實(shí)驗(yàn)，前期25℃低溫雖可長時(shí)間保存酶活，但低溫條件下酶反應(yīng)速率低，氨基酸態(tài)氮含量增長不大，30℃發(fā)酵階段的氨基酸態(tài)氮含量開始有了較為明顯的增加，所以，取消25℃，采用前期30℃發(fā)酵溫度。后期45℃僅5d時(shí)間，氨基酸態(tài)氮含量明顯不如低鹽固態(tài)發(fā)酵的對照組，蛋白質(zhì)一般經(jīng)過8d～10d水解可基本完成，因此，適當(dāng)延長后期45℃發(fā)酵時(shí)間為10d。在此基礎(chǔ)上，第二次的探索實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)階段，發(fā)酵周期為30d，前期30℃、20d；后期45℃、10d。制醅同樣采用15%、21%、27%3個(gè)鹽濃度。跟蹤測定發(fā)酵過程中蛋白酶、糖化酶、氨基酸態(tài)氮含量、總酸、總糖、還原糖含量的變化。

由圖7～圖9可見，第二次發(fā)酵過程酶活變化規(guī)律同第一次發(fā)酵相似，驗(yàn)證了低溫對酶活的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)組的中性蛋白酶活性在后期45℃的前2d有較大幅度下降；酸性蛋白酶酶活損失較快；在整個(gè)發(fā)酵過程中也都可以檢測到糖化酶的活性。

總酸的含量變化見圖10，在發(fā)酵過程中，總酸含量大體呈上升趨勢，在個(gè)別測定點(diǎn)雖會(huì)有所下降，但下降程度不是很明顯。對照組和3組實(shí)驗(yàn)組（15%、21%、27%）的總酸含量分別由起始的0.0415g/100mL、0.0241g/100mL、0.0291g/100mL、0.0291g/100mL增加到發(fā)酵結(jié)束時(shí)的0.1445g/100mL、0.0557g/100mL、0.0665g/100mL、0.0739g/100mL。

圖7 發(fā)酵過程中中性蛋白酶活性變化曲線Fig.7 Neutral protease activity change in soy sauce fermentation

圖8 發(fā)酵過程中酸性蛋白酶活性變化曲線Fig.8 Acidic protease activity change in soy sauce fermentation

圖9 發(fā)酵過程中糖化酶活性變化曲線Fig.9 Glucoamylase activity change in soy sauce fermentation

圖10 發(fā)酵過程中總酸含量變化曲線Fig.10 Total acid content change in soy sauce fermentation

由圖11所示，第二次發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化的規(guī)律較第一次明顯。整個(gè)過程中氨基酸態(tài)氮含量呈上升趨勢。對照組始終高于實(shí)驗(yàn)組，說明傳統(tǒng)的45℃發(fā)酵有利于氨基態(tài)氮的生成。對照組的氨基酸態(tài)氮含量由起始的0.0427g/100mL上升到最終的0.0861g/100mL；15%、21%、27%鹽水含量的實(shí)驗(yàn)組分別上升到0.0684g/100mL、0.0657g/100mL、0.0508g/100mL。3組實(shí)驗(yàn)組在發(fā)酵過程中的對比，氨基酸態(tài)氮含量的高低大體為15%鹽濃度最高，說明高的食鹽含量降低了酶反應(yīng)速率，同時(shí)也抑制產(chǎn)物氨基酸態(tài)氮的生成。在以后的實(shí)驗(yàn)中，采用15%的鹽濃度。

圖12 發(fā)酵過程中總糖含量變化曲線Fig.12 Total sugar content change in soy sauce fermentation

圖13 發(fā)酵過程中還原糖含量變化曲線Fig.13 Reducing sugar content change in soy sauce fermentation

圖12、圖13所示規(guī)律與第一次實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)組的還原糖和總糖含量在18d左右，對照組在22d左右有所下降。也是由于美拉德反應(yīng)和酵母酒精發(fā)酵造成的。

將實(shí)驗(yàn)組與45℃發(fā)酵對照組進(jìn)行低鹽固態(tài)發(fā)酵，得到醬油主要質(zhì)量指標(biāo)比較見表3。這批實(shí)驗(yàn)組延長了后期45℃發(fā)酵時(shí)間，醬油成品的色澤、醬香味與對照組不相上下。

表3 實(shí)驗(yàn)組與對照組低鹽固態(tài)法發(fā)酵醬油質(zhì)量指標(biāo)比較Table 3 Comparison of indices of low-salt solid-state fermentation soy sauce between the experimental group and the blank group

由表3可知，這批發(fā)酵的氨基酸態(tài)氮、總氮和總酸含量較第一次實(shí)驗(yàn)效果明顯提高，說明溫度變化設(shè)計(jì)較上次合理。其中，15%鹽水含量的實(shí)驗(yàn)組的氨基酸態(tài)氮含量與對照組的最為接近。同第一次實(shí)驗(yàn)一樣，實(shí)驗(yàn)組的氨基酸態(tài)氮生成率均比對照組的高，說明了低溫可能更好地促進(jìn)總氮轉(zhuǎn)化為氨基酸態(tài)氮。4組醬油成品游離氨基酸分析結(jié)果見表4。

表4 實(shí)驗(yàn)組與對照組低鹽固態(tài)法發(fā)酵醬油游離氨基酸組成分析Table 4 Analysis of free amino acids composition in low-salt solidstate fermentation soy sauce between the experimental group and the control group

由表4可知，改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)較第一次實(shí)驗(yàn)的游離氨基酸總量明顯提高。雖仍低于對照組，但值得關(guān)注的是，鮮味氨基酸的含量較對照組有大幅度提高，以15%鹽水含量的實(shí)驗(yàn)組效果最為明顯，其鮮味氨基酸含量7.949mg/mL，較對照組的6.546mg/mL提高了21.42%；苦味氨基酸、甜味氨基酸及其他都有所減少。另外，21%鹽水含量的實(shí)驗(yàn)組的鮮味氨基酸也比對照組的高。21%、27%鹽水含量的實(shí)驗(yàn)組的甜味氨基酸、其他氨基酸有所減少，苦味氨基酸有所增加。由于谷氨酸賦予了醬油的鮮味尤為重要，因此綜合考慮，15%鹽水含量的實(shí)驗(yàn)組最為理想，在下一步的工作中采用15%的鹽水含量。

2.3 改進(jìn)的兩階段溫度條件下溫度與酶活性、醬油風(fēng)味物質(zhì)組成關(guān)系

在前兩次實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對方案進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)整。采用15%的鹽水濃度，將45℃發(fā)酵時(shí)間進(jìn)一步延長為15d；發(fā)酵分為2個(gè)階段，30℃發(fā)酵和45℃發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)方案：

①前期30℃發(fā)酵，時(shí)間分別為5d、10d 2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，后期都為45℃發(fā)酵15d，發(fā)酵周期分別為20d、25d，目的是考察前期低溫發(fā)酵酶活保持穩(wěn)定對于發(fā)酵的影響。

②前期都為45℃發(fā)酵15d，后期低溫30℃發(fā)酵，時(shí)間分別為5d、10d 2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，發(fā)酵周期分別為20d、25d，目的是考察前期低溫和后期低溫對于酵母菌、乳酸菌繁殖的效果。

同時(shí)以45℃低鹽固態(tài)發(fā)酵為對照實(shí)驗(yàn)。

按照上述實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行低鹽固態(tài)發(fā)酵，得到的醬油主要理化指標(biāo)比較見表5。

表5 不同發(fā)酵周期醬油質(zhì)量指標(biāo)比較Table 5 Comparison of indices of different fermentation periodic soy sauce

由表5可知，前高溫后低溫的實(shí)驗(yàn)組較前低溫后高溫的實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)略高；25d發(fā)酵的各項(xiàng)理化指標(biāo)比20d發(fā)酵有所提高，且與對照組的更為接近。其中，前高溫后低溫發(fā)酵醬油成品較前低溫后高溫的總糖含量、還原糖含量高出很多，且前高溫后低溫、25d發(fā)酵醬油成品的總糖、還原糖含量較對照組的高1.36mg/mL、2.83mg/mL，這將有利于后期酵母酒精發(fā)酵及產(chǎn)醇、產(chǎn)酯。因此，采用前高溫后低溫、25d的發(fā)酵方式較為合理。

按照上述實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行低鹽固態(tài)發(fā)酵，得到的醬油游離氨基酸分析見表6。

表6 不同發(fā)酵周期醬油游離氨基酸組成分析Table 6 Analysis of free amino acids composition in different fermentation periodic soy sauce

由表6可知，25d發(fā)酵醬油的游離氨基酸總量比20d發(fā)酵醬油有所提高。這說明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，有利于游離氨基酸的生成。雖然前低溫后高溫的發(fā)酵中鮮味氨基酸的增加、苦味氨基酸的減少較前高溫后低溫的效果明顯，但后者與對照組相比，效果也很明顯。結(jié)合2種發(fā)酵方式的醬油理化指標(biāo)比較，確定可參考的新工藝參數(shù)為：前期45℃發(fā)酵15d，后期30℃發(fā)酵10d，發(fā)酵周期為25d。

3 發(fā)酵溫度與酶活性、醬油風(fēng)味物質(zhì)組成內(nèi)在關(guān)系研究的應(yīng)用可能性

由發(fā)酵溫度的初步探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，前期低溫對于蛋白酶活性的保持有很明顯的效果。而對照組整個(gè)發(fā)酵過程保持45℃，不利于蛋白酶活性的保持，但是低溫會(huì)降低酶促反應(yīng)的速率，因此實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵過程中和醬油成品的理化指標(biāo)較對照組有所下降。其中，氨基酸態(tài)氮在前期的低溫階段氨基態(tài)氮含量增加有限，在后期45℃發(fā)酵中，氨基酸態(tài)氮含量的增加較低溫階段明顯。對于醬油成品，雖然實(shí)驗(yàn)組的總氮含量不如對照組，但氨基酸態(tài)氮生成率卻高于對照組，所以，前期低溫發(fā)酵能很好地使總氮轉(zhuǎn)化為氨基酸態(tài)氮。由游離氨基酸分析可知，3組實(shí)驗(yàn)組的游離氨基酸總量都沒有對照組高。但15%鹽水含量實(shí)驗(yàn)組的鮮味氨基酸含量為3.687mg/mL，較對照組3.223mg/mL高出14.39%，苦味氨基酸較對照組降低了35.23%；甜味和其他氨基酸也有所下降。由于前期25℃發(fā)酵階段氨基酸態(tài)氮含量增長不多，30℃發(fā)酵階段氨基酸態(tài)氮含量開始有了較為明顯的增加。因此，可以摒棄25℃發(fā)酵階段，前期采用30℃發(fā)酵，后期45℃發(fā)酵即可。

由兩階段發(fā)酵溫度探索實(shí)驗(yàn)可知，由于溫度的調(diào)整，發(fā)酵過程以及醬油成品的各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于第一次實(shí)驗(yàn)。其中，15%鹽水含量實(shí)驗(yàn)組的鮮味氨基酸含量為7.949mg/mL，較對照組的6.546mg/mL提高了21.42%；苦味氨基酸含量為5.574mg/mL，較對照組的6.977mg/mL減少了20.12%。

由改進(jìn)的兩階段發(fā)酵溫度實(shí)驗(yàn)可知，前高溫后低溫、25d發(fā)酵醬油較對照組相比，鮮味氨基酸增加了21.58%，苦味氨基酸減少了21.61%，總糖含量、還原糖含量也比對照組含量高。綜合考慮各種游離氨基酸含量及醬油各種理化指標(biāo)，確定采用前期45℃發(fā)酵15d，后期30℃發(fā)酵10d，發(fā)酵周期25d的新工藝是有可能性的。

（略）