陳偉新 楊立群

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院普外科，上海 201700；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽醫(yī)院ICU，上海 200433）

文獻(xiàn)［1］報(bào)道烏司他丁（ulinastatin，UTI）預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）損傷具有保護(hù)作用，它可以選擇性降低再灌注時(shí)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，并且減輕肝細(xì)胞的壞死和凋亡，但其具體機(jī)制目前尚不清楚。高遷移率蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種重要的內(nèi)源性損傷相關(guān)分子，它廣泛分布于哺乳動(dòng)物淋巴組織及腦、肝、肺、心、脾、腎等器官中，它在肝、腦組織中主要存在于胞漿，但在大多數(shù)其他組織中存在于胞核。生理狀態(tài)下HMGB1的表達(dá)量維持在極低的基礎(chǔ)水平［2］。HMGB1介導(dǎo)了內(nèi)毒素誘導(dǎo)的膿毒癥，其是內(nèi)毒素致死效應(yīng)的晚期重要炎癥介質(zhì)。HMGB1在體內(nèi)不同器官分布廣泛，但目前尚無報(bào)道HMGB1是否參與了UTI抑制肝臟IR后炎性反應(yīng)的過程，本研究旨在探討這一問題。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量250～300g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠在空調(diào)室內(nèi)飼養(yǎng)，室溫22～25℃，自由進(jìn)水和食物，術(shù)前12h禁食不禁水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型的制作 首先將SD大鼠隨機(jī)分為4組。建立左、中肝門靜脈阻斷的IR模型，先阻斷大鼠門靜脈左、中分支45min，然后開放動(dòng)脈夾再灌注2h。0.9%氯化鈉對(duì)照組（對(duì)照組，n＝10）：再灌注前5min尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液6mL／kg。UTI預(yù)處理組（UTI組，n＝10）：再灌注前5min尾靜脈注射 UTI（20U／mL）1.5mL／kg。UTI＋誘導(dǎo)劑組（UTI＋rHMGB1組，n＝10）：阻斷前1h予重組HMGB1蛋白10μg腹腔注射，余同 UTI組。UTI＋拮抗劑組（UTI＋Anti－HMGB1組，n＝10）：阻斷前1h予 Anti－HMGB1抗體100μg腹腔注射，余同UTI組。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血漿中細(xì)胞因子的水平 再灌注后取新鮮血液4～5mL，37℃靜置30min、4℃靜置2h后3 000r／min離心15min，小心吸取上層血清200μL裝于EP管中，采用TNF－α和IL－1特異性ELISA試劑盒，根據(jù)說明書步驟操作。

1.2.3 肝組織光鏡標(biāo)本HE染色病理觀察 光鏡下評(píng)定肝組織損傷分級(jí)，其分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，肝小葉、肝細(xì)胞、肝細(xì)胞索、中央靜脈、肝竇均正常；Ⅰ級(jí)，肝中央靜脈、肝竇內(nèi)瘀血及少量肝細(xì)胞變性壞死，肝組織內(nèi)可見炎細(xì)胞聚集，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；Ⅱ級(jí)，肝中央靜脈、肝竇內(nèi)瘀血及較多肝細(xì)胞變性壞死，肝組織內(nèi)炎細(xì)胞聚集較多，肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整；Ⅲ級(jí)，肝中央靜脈、肝竇內(nèi)瘀血及廣泛肝細(xì)胞變性壞死，大量炎細(xì)胞聚集，部分肝組織結(jié)構(gòu)破壞不完整。

1.2.4 肝臟組織HMGB1蛋白表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)染色（S－P法）檢測(cè)。肝組織HMGB1表達(dá)結(jié)果判斷方法：在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，陽性為細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核上棕黃色顆粒樣沉淀。－：細(xì)胞膜不著色，與背景一致；＋：膜呈棕黃色的細(xì)胞數(shù)＜25%或大多數(shù)細(xì)胞的膜呈淡黃色；＋＋：膜呈棕黃色的細(xì)胞數(shù)占25%～80%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。對(duì)符合正態(tài)分布和方差齊性的資料進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。對(duì)不符合正態(tài)分布的資料和等級(jí)資料計(jì)算中位數(shù)（median，M）和四分位數(shù)（quartile，Q），進(jìn)行非參數(shù)Kruskal－Wallis檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Nemenyi法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的比較 見表1。

2.2 各組血清細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α（TNF－α）和白細(xì)胞介素（IL－1）含量的比較 見表2。2.3 肝組織病理學(xué)及HMGB1蛋白表達(dá)水平的改變 UTI組和UTI＋Anti－HMGB1組肝細(xì)胞壞死和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)顯著輕于對(duì)照組，見圖1；且UTI組和UTI＋Anti－HMGB1組肝細(xì)胞 HMGB1的表達(dá)程度顯著低于其他兩組（P＜0.05），見圖2。

表1 ALT和AST在各組中的比較

表2 TNF－α和IL－1在各組中的比較

3 討 論

UTI是從人尿中提取精制的一種糖蛋白水解酶抑制劑，又稱尿胰蛋白酶抑制劑，其相對(duì)分子質(zhì)量為67 000，它對(duì)胰蛋白酶、糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細(xì)胞彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、琉基酶、纖溶酶等多種酶具有抑制作用。UTI分解形成的相對(duì)分子質(zhì)量較低的成分也具有很強(qiáng)的抑制蛋白水解酶的作用［3］。本研究發(fā)現(xiàn)UTI預(yù)處理后，UTI組IR后血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）與對(duì)照組相比均顯著降低，表明UTI預(yù)處理對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。UTI組IR后血清TNF－α和IL1水平與對(duì)照組相比均顯著降低，表明UTI預(yù)處理是通過抑制炎性細(xì)胞因子的釋放發(fā)揮其對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用，病理觀察結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

高遷移率族蛋白（high mobility group，HMG）由Johns于1973年首次在牛胸腺中提取和鑒定，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中具有高遷移能力而得名。根據(jù)分子質(zhì)量大小、序列相似性和DNA結(jié)構(gòu)特性，HMG 可進(jìn)一步分為 HMGA、HMGB、HMGN 3個(gè)家族。HMGB家族有3個(gè)成員，即HMGB1、HMGB2和HMGB3，三者在氨基酸序列上有80%的一致性。HMGB1是含量最豐富的HMG蛋白［4］。在正常情況下，HMGB1一部分存在于肝細(xì)胞胞漿中，一部分存在于肝細(xì)胞胞核維持DNA結(jié)構(gòu)。當(dāng)細(xì)胞壞死或受損時(shí)，核內(nèi)的HMGB1可釋放到胞外，促使單核巨噬細(xì)胞分泌促炎因子；而促炎因子又反過來促進(jìn)巨噬細(xì)胞主動(dòng)分泌HMGB1，由此形成正反饋。IR誘導(dǎo)的肝損傷中，肝細(xì)胞大量壞死、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)斷裂、胞核結(jié)構(gòu)破裂，HMGB1被動(dòng)釋放至細(xì)胞外，作為重要炎癥啟動(dòng)因子介導(dǎo)IR后炎性反應(yīng)。另外，在缺血的傷害性刺激因素作用下，肝臟內(nèi)庫弗氏細(xì)胞主動(dòng)分泌HMGB1至胞外。Tsung等［5］發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟IR損傷后HMGB1的表達(dá)增強(qiáng)，其表達(dá)從再灌注后1h即開始上調(diào)并持續(xù)至再灌注后24h，且呈時(shí)間依賴性。通過本實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)了HMGB1可以拮抗UTI對(duì)肝臟IR損傷后炎性反應(yīng)的抑制作用。

綜上所述，我們認(rèn)為內(nèi)源性損傷蛋白HMGB1介導(dǎo)的炎性通路與UTI對(duì)肝IR損傷的保護(hù)作用機(jī)制有關(guān)。

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