張宇浩 馬昱 郭曦 王勤 曹志娟

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院分部?jī)?nèi)科，上海 200052；3.空軍94789部隊(duì)機(jī)關(guān)醫(yī)院口腔科，江蘇南京 210018；4.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 200032）

存在于腦組織和腦脊液中的多種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)于調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)具有重要作用，其含量及比例的變化伴隨著多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生及發(fā)展［1］。其中，谷氨酸（glutamate，Glu）和天門冬氨酸（aspartate，Asp）是腦部的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，?；撬幔╰aurine，Tau）是腦部的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，γ－GABA）的作用較為復(fù)雜。測(cè)定神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷、治療和預(yù)后分析有重要的參考價(jià)值。常用的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的測(cè)定方法為高效液相色譜法、微流控、電泳法分離與衍生化后熒光檢測(cè)相結(jié)合［2－3］。通常采用丹酰氯衍生化、鄰苯二甲醛（O－phthalaldehyde，OPA）、2，4－二硝基氟苯、2，6－二甲基－4－喹啉羧酸－N－羥基琥珀酰亞胺酯［4］等試劑進(jìn)行柱前衍生熒光檢測(cè)氨基酸的含量［4］。其中，OPA檢測(cè)的靈敏度高，衍生化反應(yīng)迅速安全。本研究對(duì)大鼠腦組織中的神經(jīng)遞質(zhì)的測(cè)定，采用OPA作為柱前衍生化試劑，建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的高效液相色譜技術(shù)，以期為神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供方法基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 試劑和儀器 Asp、Glu、γ－GABA、Tau和OPA（純度80%）購(gòu)自于上海日初生化有限公司；高絲氨酸（homoserine，Hse）和β－巰基乙醇購(gòu)自于Sigma公司。乙腈和甲醇購(gòu)于漢邦試劑有限公司，均為一級(jí)色譜純。高氯酸、磷酸二氫鉀、碳酸鉀等試劑均購(gòu)自于國(guó)藥試劑集團(tuán)，分析純。超純水由Millipore公司生產(chǎn)的Milli－Q純水儀制備。

液相色譜儀系統(tǒng)：HITACHI L2000型高效液相色譜儀，包括 Hitachi Organizer（試劑架），L－2130型四元泵、L－2200型自動(dòng)進(jìn)樣器，L－2300型柱溫箱，L－2455型二極管陣列檢測(cè)器，L－2485型熒光檢測(cè)器，日立色譜工作站，由日本日立公司提供。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Dikma Inertsil ODS（250mm× 4.6mm，3.5μm），預(yù)柱 Dikma，C18，4.0mm×3.0mm。流動(dòng)相為磷酸二氫鉀緩沖液（0.1mol／L，pH 6.0）∶甲醇∶乙腈 （6∶3∶1）；流速為1mL／min；檢測(cè)條件：熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)為345nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460nm。柱溫40℃，進(jìn)樣量20μL。

1.2.2 試劑配制

1.2.2.1 衍生化試劑的配制及衍生反應(yīng) 稱取13.4mg的OPA溶于1mL的乙醇中，加入20μL β－巰基乙醇以及4mL四硼酸鈉緩沖液（0.1mol／L，pH 9.6）。密封后低溫保存。隔天加入20μLβ－巰基乙醇。標(biāo)準(zhǔn)溶液和預(yù)處理后樣品精密量取40 μL，加入OPA衍生劑20μL輕輕混勻，靜置2min，進(jìn)樣20μL進(jìn)行高效液相色譜分析。以保留時(shí)間定性，峰面積內(nèi)標(biāo)法定量。

1.2.2.2 儲(chǔ)備液的配制 精密稱定 Asp 13.10 mg、Glu 14.71mg、γ－GABA 10.31mg 和 Tau 12.53mg，分別置10mL容量瓶中，加入含50%甲醇的0.1mol／L碳酸鉀溶液（Buffer A）定容，制得濃度為10mmol／L的各種氨基酸母液。精密稱取Hse 119.12mg置100mL量瓶中，加入Buffer A溶解，定容制得10mmol／L的內(nèi)標(biāo)母液。精密吸取Asp、Glu、γ－GABA和Tau母液各1.0mL，分別置10mL量瓶中，Buffer A稀釋定容，作為1號(hào)儲(chǔ)備液（1mmol／L）；再次精密吸取1mL各氨基酸的1號(hào)儲(chǔ)備液，分別置10mL量瓶中，Buffer A定容作為2號(hào)儲(chǔ)備液（100μmol／L），－20℃保存。提取回收率儲(chǔ)備液配制：精密吸取10mmol／L的 Asp、Glu、γ－GABA和Tau母液0.3mL置于同10mL量瓶中，Buffer A稀釋定容即得3號(hào)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.3 mmol／L）。

精密量取3mL的內(nèi)標(biāo)母液置100mL的量瓶中，Buffer A稀釋定容可得1號(hào)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（0.3 mmol／L）；精密量取1mL的內(nèi)標(biāo)母液，置10mL的量瓶中，Buffer A稀釋定容可得2號(hào)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（1mmol／L）；精密量取2號(hào)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1mL，置100mL容量瓶中，用Buffer A稀釋定容得3號(hào)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（10μmol／L）。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取Asp、Glu、γ－GABA、Tau的2號(hào)儲(chǔ)備液各1.0mL置同一個(gè)10mL量瓶中，用Buffer A稀釋定容，作為1號(hào)工作液（10μmol／L）。隨后，精密取1號(hào)工作液0.1 mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL和3號(hào)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1mL置同一個(gè)10mL量瓶中，用Buffer A稀釋定容，作為2、3、4、5、6號(hào)工作溶液，濃度依次為0.1 μmol／L、0.2μmol／L、0.5μmol／L、1μmol／L、2 μmol／L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中內(nèi)標(biāo)液濃度均為1 μmol／L。按以上實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣，每次進(jìn)樣20μL，測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中各組分的峰面積，計(jì)算其與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，并擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.2.4 精密度和準(zhǔn)確度測(cè)定 配制濃度為0.5 μmol／L氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5管，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法處理，衍生后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)精密度和回收率；以相同方法配制相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品5份，連續(xù)3d，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算日間精密度和回收率。

1.2.5 提取回收率 取0.4mL人工腦脊液（配置方法：每100mL蒸餾水含NaCl 730mg，KCl 10 mg，NaH2PO4·H2O 12.5mg，Na2HPO4·12H2O 71mg，MgCl2·6H2O 20mg，CaCl218mg，D－葡萄糖90mg，pH 7.3～7.5），加入50μL的3號(hào)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.3mmol／L）和50μL的3號(hào)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（0.3mmol／L），再加入1mL 的 HClO4（0.4 mol／L）去蛋白，混勻后，4℃條件下，3 000r／min低溫離心15min，取上清液0.5mL，加入2mol／L K2CO3溶液1mL，再加入0.1mol／L K2CO3稀釋至5mL，4℃條件下，14 000r／min低溫離心20 min，取上清，4℃保存，衍生后，分別取20μL進(jìn)樣，計(jì)算提取回收率的4種氨基酸的濃度CX（μmol／L）。按下列公式計(jì)算提取回收率。回收率（%）＝30 000CX／C0×100%，其中C0為3號(hào)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的濃度（0.3mmol／L）。

1.2.6 腦組織樣品預(yù)處理 SD大鼠（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）1只，體質(zhì)量248g，快速斷頭取腦，放在冰盤上分離腦組織，留取海馬組織，精密稱質(zhì)量后，加入0.8mL人工腦脊液，手動(dòng)玻璃勻漿器冰浴勻漿，4℃條件下，3 000r／min低溫離心15min，取上清液0.4mL，加入50 μL的3號(hào)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.3mmol／L）和50μL的3號(hào)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（0.3mmol／L）和1mL的HClO4（0.4mol／L）去蛋白，混勻后，4℃條件下，3 000r／min低溫離心15min，取上清液0.5mL，加入2mol／L K2CO3溶液1mL，再加入0.1mol／L K2CO3稀釋至5mL，4℃條件下，14 000r／min低溫離心20min，取上清液，4℃保存，用前衍生后進(jìn)樣。

2 結(jié) 果

2.1 4種氨基酸的分離 4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)在15min內(nèi)均得以很好的分離，其保留時(shí)間分別為：Asp 3.60min，Glu 3.89min，Hse 7.45min，Tau 11.47min，γ－GABA 13.29min。各種氨基酸峰形良好，無(wú)重合、雙峰、拖尾等現(xiàn)象。樣品中的其他雜峰亦可與待測(cè)氨基酸完全分離。

2.2 線性范圍和相關(guān)系數(shù) 系列濃度的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（2～6號(hào)工作溶液）進(jìn)行HPLC檢測(cè)后，各峰面積與濃度間呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。以各種氨基酸組分濃度（C）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積（A）與內(nèi)標(biāo)峰面積（A0）的比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，其濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系，得到的回歸方程式：y＝ax＋b。其中y為峰面積比值，a為斜率，x為各氨基酸的濃度，b為截距，相關(guān)系數(shù)r。見(jiàn)表1。

表1 各種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.3 精密度和準(zhǔn)確度 在所建立的HPLC方法下，測(cè)定同一樣品中4種氨基酸的精密度，結(jié)果顯示其重現(xiàn)性較好，高、中、低3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)5次進(jìn)樣，Asp、Glu、Tau和γ－GABA峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的日內(nèi)和日間變異系數(shù)分別為0.61%～7.91%、4.78% ～6.26%、10.5% ～16.3% 和 0.27% ～10.98%，回收率分別為90.5%～111.3%、90.8%～101.5%、98.6%～101.9%和95.6%～104.4%。2.4 提取回收率試驗(yàn) 3個(gè)空白樣品中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品完成，經(jīng)過(guò)樣品預(yù)處理方法進(jìn)行處理后，對(duì)比檢測(cè)量和實(shí)際量，多次測(cè)定Asp、Glu、Tau 和 γ－GABA 提 取 回 收 率 分 別 為91.1%～112.2%、82.7% ～99.3%、66.8% ～98.8%和86.2%～104.0%。

3 討 論

本研究采用OPA柱前衍生，建立了一種高效液相－熒光檢測(cè)技術(shù)，方法準(zhǔn)確靈敏、重現(xiàn)性好，適合于腦組織樣品中各種氨基酸的檢測(cè)。本研究用的熒光衍生試劑純度為80%，帶入了一些干擾成分，雖然在本研究條件下，干擾成分不影響4種氨基酸的測(cè)定，但可考慮在以后的研究中換用更純的試劑，以降低干擾。由于OPA試劑性質(zhì)活潑，放置于空氣中易氧化，因此在其保存液中加入β－巰基乙醇，對(duì)OPA具有保護(hù)作用，并將其保存于較低溫度也可防止其氧化變質(zhì)。此外，腦組織樣品中也具有多種成分的干擾，本研究中采用60mmol／L磷酸鹽濃度作為流動(dòng)相添加劑，獲得了較好的峰形和分離度。從圖譜上可以看出，若樣品中添加其他的氨基酸如組氨酸（6.12min）、甘氨酸（8.87min）等，其測(cè)定將一定程度上受到組織樣品的干擾，后續(xù)研究將進(jìn)一步觀察流動(dòng)相組成成分和比例，以期用于更多組分的檢測(cè)。

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