顧金萍 陶俊 范建霞

（上海交通大學(xué)附屬國際和平婦幼保健院，上海 200030）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是女性最常見的內(nèi)分泌與生殖功能障礙性疾病，育齡婦女PCOS的患病率約為10%［1］。PCOS病因復(fù)雜，可能受遺傳和環(huán)境因素共同影響。肥胖相關(guān)基因（fat mass and obesity associated gene，F(xiàn)TO）與PCOS發(fā)病具有非常密切的關(guān)系［2］。在基因組變異中，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymophism，SNP）是一種主要形式。已有研究［3］顯示PCOS人群FTO基因的SNP與其發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。本研究探討PCOS患者的子代是否也具有上述FTO雜合性變異。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年6月—2011年4月在上海交通大學(xué)附屬國際和平婦幼保健院定期產(chǎn)檢并分娩的孕婦55例，其中28例PCOS治療后孕婦為研究組（PCOS組）（診斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格遵照2003年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)）；另27例為年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）與研究組匹配的健康產(chǎn)婦為對照組。研究組平均年齡（28.63±2.39）歲，對照組平均年齡（28.87±3.18）歲，兩組平均年齡無顯著差異（P＝0.78）。PCOS組孕前平均BMI（23.79±3.42）kg／m2，對照組孕前平均BMI（24.06±3.45）kg／m2，兩組孕前平均BMI無顯著差異（P＝0.776）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胎盤組織 DNA抽提 （1）將200μL胎盤組織中加入400μL細(xì)胞裂解液混勻，再加入6μL蛋白酶K混勻，置于55℃水浴20min，期間混勻幾次；（2）加入600μL氯仿后充分混勻；（3）12 000r／min，室溫離心2min。離心管內(nèi)液體呈3層，基因組DNA在上層中，取上層清液500μL，置于無菌1.5mL離心管中；（4）加入500μL沉淀液后混勻，室溫放置2min后以12 000r／min，離心2min；（5）棄上清，立即加入100μL的1.2mol／L氯化鈉溶液，輕輕振蕩直至DNA樣品完全溶解，加入2μL RNA酶，置于37℃10min；（6）加入300μL冰冷乙醇，－20℃放置10min后以12 000r／min，離心5～8min，離心后吸走或倒掉乙醇，用70%乙醇洗1次，倒置室溫干燥10min。然后加入100μL TE溶解DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR引物設(shè)計(jì)見表1，擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物采用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠電泳成像分析儀上觀察結(jié)果；然后將目的條帶用ABI Prism 7900HT序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行純化測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 檢測FTO基因rs1421085（C／T）位點(diǎn)SNP的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)與百分率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FTO基因rs1421085（C／T）PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 見圖1。如圖中所示，第13～25泳道條帶與標(biāo)志物位置對比在250bp與500bp之間且靠近500 bp處。而1～12泳道與標(biāo)志物位置對比顯然與第13～25泳道有異，故切下條帶，繼續(xù)測序，進(jìn)一步明確基因型的差異。

圖1 FTO基因rs1421085電泳結(jié)果

2.2 PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果及分析 對55例孕婦胎盤組織中的FTO基因rs1421085（C／T）PCR產(chǎn)物測序分析后，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)共出現(xiàn)3種基因型，分別為T／T、T／C和C／C基因型。其中T／T基因型共有45例（19例出現(xiàn)在PCOS組，26例出現(xiàn)在對照組），T／C基因型共有8例（7例出現(xiàn)在PCOS組，1例出現(xiàn)在對照組），C／C基因型共有2例（2例均出現(xiàn)在PCOS組）。

2.3 FTO基因rs1421085（C／T）位點(diǎn)的基因型頻率 2組等位基因頻率比較，具有顯著差異（χ2＝7.2160，P＝0.0072）。2組基因型頻率比較，具有顯著差異（χ2＝4.800，P＝0.0285）。

表2 等位基因頻率及基因型頻率比較［n（%）］

3 討 論

FTO基因定位于人類16號染色體長臂，包含9個(gè)外顯子，410 507個(gè)堿基。FTO基因在胎兒以及成人組織中廣泛表達(dá)，尤其在下丘腦、垂體、腎上腺組織和胰島細(xì)胞中表達(dá)水平較高。研究［4］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO與肥胖及肥胖相關(guān)疾病如2型糖尿病、代謝綜合征的發(fā)生相關(guān)。攜帶有FTO危險(xiǎn)基因型的個(gè)體，體質(zhì)量明顯較大，并且伴有糖耐量下降、胰島素抵抗等內(nèi)分泌紊亂及代謝綜合征。Gerken等［5］認(rèn)為，F(xiàn)TO基因催化活性可能是通過去甲基化的機(jī)制調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響肥胖；也可能是與其同源蛋白ABH2一樣，F(xiàn)TO蛋白充當(dāng)核酸修復(fù)酶的作用。FTO基因的變異可能損傷了基因組的修復(fù)過程，從而導(dǎo)致肥胖和代謝綜合征。

本研究收集了PCOS孕婦和正常孕婦胎兒的胎盤組織，分離其基因組DNA，并針對FTO基因SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。通過PCR產(chǎn)物測序及序列對比，結(jié)果顯示正常孕婦胎盤組織FTO基因rs1421085（C／T）SNP基因型以“T／T”為主，而在PCOS孕婦胎盤組織中，F(xiàn)TO基因rs1421085（C／T）SNP位點(diǎn)雜合性突變主要表現(xiàn)為“TT→TC”或“TT→CC”。當(dāng)FTO基因的SNP位點(diǎn)發(fā)生變異時(shí)，原本編碼的氨基酸突變成另一種氨基酸，從而導(dǎo)致其最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物出現(xiàn)功能性差異。由此推測，PCOS孕婦子代FTO基因SNP位點(diǎn)的變異率比正常孕婦分娩的胎兒高，PCOS患者子代具有PCOS及肥胖等代謝綜合征的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

［1］ Goodarzi MO，Dumesic DA，Chazenbalk G，et al.Polycystic ovary syndrome：etiology，pathogenesis and diagnosis［J］.Nat Rev，2011，7（4）：219－231.

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［3］ Barber TM，Bennett AJ，Groves CJ，et al.Association of variants in the fat mass and obesity associated（FTO）gene with polycystic ovary syndrome［J］.Diabetologia，2008，51（7）：1153－1158.

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［5］ Gerken T，Girard CA，Tung YC，et al.The obesity－associated FTO gene encodes a 2－oxoglutarate－dependent nucleic acid demethylase［J］.Science，2007，318（5855）：1469－1472.