霍守俊 薛鋒 孔凡志 李芳 單遠(yuǎn)州＊ 周聯(lián)明＊ 張學(xué)利＊

（1.蘇州大學(xué)，江蘇蘇州 215006；2.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院骨科，＊普外科，上海 201400）

胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，胃癌患者的5年生存率僅約30%［1］，目前胃癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本課題組在前期研究中首次發(fā)現(xiàn)miR－650在胃癌中表達(dá)異常升高，并初步探討了miR－650在胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等方面的調(diào)控作用［2］。本研究旨在進(jìn)一步探討miR－650參與胃癌發(fā)生的相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 胃癌細(xì)胞株及培養(yǎng) KATO III、NUGC4、NCI－N87、SGC－7901及 MKN－45胃癌細(xì)胞株的培養(yǎng)條件如下：KATO III培養(yǎng)液為 ATCC－formulated Iscove＇s Modified Dulbecco＇s Medium（IMDM）培養(yǎng)基（內(nèi)含20%胎牛血清）；NUGC4、NCI－N87、SGC－7901及 MKN－45細(xì)胞株培養(yǎng)液均為RPMI－1640培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清）；細(xì)胞孵育環(huán)境為：37℃且含95%空氣、5%CO2的培養(yǎng)箱。

1.2 臨床資料 根據(jù)美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）胃癌臨床實(shí)踐指南（2003版）中收錄的診療標(biāo)準(zhǔn)，共收集68例于2005年6月—2010年1月在上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院就診的胃癌患者，所有患者在確診胃癌后，限期行標(biāo)準(zhǔn)胃癌根治術(shù)并輔助放化療，全部患者至少隨訪2年以上。該項(xiàng)研究在征得患者及家屬同意后簽署知情同意書，并征得上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.3 試劑及儀器 iTRAQ試劑盒（美國(guó)ABI公司），SYBR PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），RNA提取試劑盒（德國(guó) QIAGEN公司），IVIS Spectrum成像系統(tǒng)（美國(guó)冷泉港生物科技股份有限公司），LC－MS／MS系統(tǒng)（美國(guó)ABI公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)時(shí)定量RT－PCR 從冰凍胃癌組織及其配對(duì)正常組織中以及5株胃癌細(xì)胞株中提取總RNA，檢測(cè)RNA純度，在miR分子末端加polyA尾，選擇Oligo dT引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，以U6snRNA作為內(nèi)參，以2－ΔΔCt表示胃癌組織中miR－650表達(dá)量相對(duì)于正常組織的變化倍數(shù)，其中ΔΔCt＝（Ct－CtU6）癌－（Ct－CtU6）正常。腫瘤組織中 miR－650的表達(dá)量為正常組織表達(dá)量的3倍以上時(shí)為miR－650在胃癌組織中高水平表達(dá)。

1.4.2 慢病毒包裝及滴度測(cè)定 按說(shuō)明書制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，與Lipofectamine 2000混合后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于CO2培養(yǎng)箱孵育，收集上清液，離心收集病毒濃縮液，分裝后取其中1支進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測(cè)定，其余置于－80℃保存。

1.4.3 miR－650模擬劑和抑制劑 合成成熟 miR－650的引物，序列如下：正向：5’－AGGAGGCAGCGCTCTCAGGAC－3’。反 向：5’－CGGGCGCGTT－TTTTTTTTTTT－TTGTCCTGAGAG－3’。 miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸序列如下：5’－GTCCTGAGAGCGCTGCCTCCT－3’。以上序列與病毒基因組融合后，通過(guò)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株。

1.4.4 細(xì)胞增殖分析 SGC－7901及 NCI－N87胃癌細(xì)胞株在轉(zhuǎn)染成熟miR－650序列及miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸后，置于CO2培養(yǎng)箱孵育，分別于第1、2、3、4天加入CCK－8試劑后在分光光度計(jì)下檢測(cè)450nm的吸光率。

1.4.5 細(xì)胞凋亡分析 SGC－7901及 NCI－N87胃癌細(xì)胞株在轉(zhuǎn)染成熟miR－650序列及miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸后，孵育、離心收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.4.6 定量LC－MS∕ MS KATO III、NUGC4、NCI－N87、SGC－7901及 MKN－45胃癌細(xì)胞株在轉(zhuǎn)染成熟 miR－650序列及 miR－650抑制劑后，利用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，將5種蛋白樣品分別進(jìn)行還原和烷基化，經(jīng)胰蛋白酶水解后，分別用不同的iTRAQ試劑進(jìn)行標(biāo)記，并將所有蛋白樣品混合，通過(guò)LC－MS／MS系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析以篩選靶蛋白。

1.4.7 蛋白質(zhì)印跡（Western blot） SGC－7901及NCI－N87胃癌細(xì)胞株在轉(zhuǎn)染成熟miR－650序列及miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸后，提取其細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行western blot分析靶蛋白表達(dá)情況。

1.4.8 裸鼠異種移植模型 用含編碼綠色熒光蛋白基因的病毒轉(zhuǎn)染SGC－7901及NCI－N87胃癌細(xì)胞株后放入CO2培養(yǎng)箱孵育，取20只BALB／C裸鼠，隨機(jī)分為2組，每組10只，其中一組裸鼠腹腔注射SGC－7901細(xì)胞株，另一組裸鼠腹腔注射NCIN87細(xì)胞株，每周通過(guò)IVIS成像系統(tǒng)觀察腹腔腫瘤情況及裸鼠生長(zhǎng)情況，6周后處死并打開(kāi)腹腔觀察腫瘤大小、腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移情況。同時(shí)，另取20只BALB／C裸鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，其中一組裸鼠腹腔注射SGC－7901細(xì)胞株，另一組裸鼠腹腔注射NCI－N87細(xì)胞株。每組裸鼠標(biāo)記5只，每天腹腔給予miR－650抑制劑；同組中另5只裸鼠作為對(duì)照組，每天觀察腫瘤情況及裸鼠生長(zhǎng)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌中miR－650表達(dá)水平與患者術(shù)后生存期密切相關(guān) 胃癌患者術(shù)后生存期長(zhǎng)短與miR－650表達(dá)水平密切相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤位置、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素?zé)o相關(guān)性。見(jiàn)表1。

表1 胃癌患者預(yù)后相關(guān)因素分析

2.2 miR－650異常高表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移并抑制其凋亡 5株胃癌細(xì)胞株中，KATO III、NUGC4及SGC－7901細(xì)胞株高水平表達(dá)miR－650，而NCI－N87及MKN－45細(xì)胞株則僅微量表達(dá)miR－650（圖1）。細(xì)胞增殖分析結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染了成熟miR－650序列的胃癌細(xì)胞株相反，當(dāng)轉(zhuǎn)染miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸后，胃癌細(xì)胞株的增殖能力顯著下降（圖2）。流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡水平檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染miR－650抑制劑后，胃癌細(xì)胞株凋亡數(shù)量顯著增多（圖3）。裸鼠異種移植模型結(jié)果同樣提示，miR－650高表達(dá)可促進(jìn)胃癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移；而抑制miR－650表達(dá)后，可抑制腫瘤生長(zhǎng)并抑制其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴轉(zhuǎn)移（圖4）。

2.3 RGS7蛋白是miR－650的下游靶點(diǎn)之一，并受到miR－650的負(fù)性調(diào)控 成熟 miR－650序列及miR－650抑制劑轉(zhuǎn)染5株胃癌細(xì)胞株后，采用LCMS／MS系統(tǒng)蛋白定量分析。結(jié)果顯示：miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染高表達(dá)miR－650的3株細(xì)胞株后，5種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平始終增加，分別是MMP2前體、SERBP1，DLL4，RGS7和PRDX1。然而，將成熟miR－650序列轉(zhuǎn)染入低表達(dá)miR－650的2株胃癌細(xì)胞后，有3種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平始終偏低，分別為S100PBP，RGS7及PRDX1（圖5）。綜合以上結(jié)果，可將RGS7蛋白及PRDX1蛋白視為miR－650的潛在靶蛋白。結(jié)合miR靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件－Targetscan的篩選結(jié)果，最終確定RGS7蛋白為miR－650的下游靶點(diǎn)之一。通過(guò)western blot進(jìn)一步證實(shí)：轉(zhuǎn)染成熟 miR－650序列后，胃癌細(xì)胞株RGS7蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著下降，而當(dāng)轉(zhuǎn)染了miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸后，細(xì)胞中RGS7表達(dá)水平顯著上升（圖6），顯示出miR－650對(duì)RGS7蛋白的負(fù)性調(diào)控關(guān)系。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者術(shù)后生存期長(zhǎng)短與miR－650表達(dá)水平密切相關(guān)（P＜0.05），但是，患者生存期與患者性別、年齡、腫瘤位置、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素?zé)o顯著相關(guān)性，可能由于受到樣本量及研究對(duì)象確定標(biāo)準(zhǔn)等因素的影響，故需進(jìn)一步增加樣本量、重新制定研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)并改進(jìn)研究方法后進(jìn)行后續(xù)研究。

結(jié)合前期研究結(jié)果，我們假設(shè)：胃癌中miR－650的異常高表達(dá)通過(guò)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移并抑制其凋亡來(lái)促進(jìn)胃癌的進(jìn)展，進(jìn)而影響患者生存期及預(yù)后狀況。為了驗(yàn)證以上推論正確性，我們?cè)O(shè)計(jì)一系列實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果提示：①抑制miR－650表達(dá)時(shí)胃癌細(xì)胞增殖能力受到抑制，而miR－650過(guò)表達(dá)后可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖；②抑制miR－650表達(dá)后可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，反之，miR－650過(guò)表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞凋亡；③裸鼠胃癌異種移植模型結(jié)果同樣提示：miR－650可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，而抑制其表達(dá)可抑制腫瘤生長(zhǎng)并抑制遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴轉(zhuǎn)移。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期研究結(jié)果完全一致，但是仍不能明確miR－650下游除ING4以外的潛在靶點(diǎn)。我們綜合應(yīng)用LC－MS／MS系統(tǒng)以及Targetscan軟件，最后確定RGS7為miR－650的下游靶點(diǎn)之一。RGS7屬于RGS蛋白亞族，RGS7家族成員包括：RGS6、RGS7、RGS9及RGS11等，受G蛋白信號(hào)調(diào)控［3］。RGS7由3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成：①RGS區(qū)域：該區(qū)域相對(duì)保守，約120個(gè)氨基酸，存在于幾乎每個(gè)RGS家族成員結(jié)構(gòu)中，通過(guò)結(jié)合Gα亞基促進(jìn)GTP水解；②DEP區(qū)域：介導(dǎo)與膜錨定蛋白間相互作用；③GGL區(qū)域：與Gβ5亞基特異性結(jié)合，形成異二聚體調(diào)控視網(wǎng)膜細(xì)胞光反應(yīng)、中樞神經(jīng)元活動(dòng)等過(guò)程［4］。為了探討miR－650表達(dá)與RGS7表達(dá)之間的內(nèi)在聯(lián)系，我們通過(guò)western blot檢測(cè)miR－650對(duì)RGS7表達(dá)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者之間存在負(fù)性調(diào)控關(guān)系。

我們的研究結(jié)果初步提示，miR－650→RGS7及miR－650→ING4信號(hào)通路在胃癌形成過(guò)程中發(fā)揮作用，但胃癌的形成是一個(gè)多因素、多步驟相互作用、相互影響的復(fù)雜過(guò)程。隨著對(duì)miR與胃癌關(guān)系研究的深入，將逐步明確miR是否可以作為用于胃癌的早期診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)等的新型腫瘤標(biāo)志物。

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