高地 朱鷺冰 李明

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科，上海 200032）

系統(tǒng)性硬皮?。╯ystemic scleroderma，SSc）是一種頑固的自身免疫性疾病，其免疫紊亂表現(xiàn)在多個(gè)方面。免疫活性細(xì)胞（主要是淋巴細(xì)胞）及其相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子在SSc發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸引起關(guān)注［1］。我們的前期研究［2］顯示皮膚成纖維細(xì)胞外微環(huán)境中細(xì)胞因子異常可能參與SSc患者皮膚成纖維細(xì)胞高膠原合成克隆的形成。外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）以淋巴細(xì)胞為主，能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子。本研究旨在探討SSc患者的PBMC對(duì)具有不同膠原合成能力的皮膚克隆成纖維細(xì)胞的膠原代謝的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清由PAA公司生產(chǎn)；小鼠抗人波形蛋白、細(xì)胞角蛋白單抗由Abcam公司生產(chǎn)；兔抗人Ⅷ因子多抗由Antibody Diagnostica公司生產(chǎn)；親和素－生物素－酶復(fù)合物顯色試劑盒和生物素化馬抗小鼠、羊抗兔二抗由Vector公司生產(chǎn)；RNA提取試劑盒由Invitrogen公司生產(chǎn)和cDNA合成試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、引物和TaqMan探針由上海閃晶公司生產(chǎn)；淋巴細(xì)胞分離液、植物血凝素（phytohemaggtutinin，PHA）由Sigma公司生產(chǎn)。

1.2 研究方法

1.2.1 篩選SSc和健康皮膚具有不同膠原合成能力的異質(zhì)性成纖維細(xì)胞克隆 選取5例病程＜3年且符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1980年分類標(biāo)準(zhǔn)［3］的進(jìn)展期SSc患者（研究組）分別在局部麻醉下切取其前臂逐漸擴(kuò)大的硬化皮損邊緣的皮膚組織；同時(shí)選取4例性別、年齡匹配的整形外科手術(shù)者（對(duì)照組），在局部麻醉下切取其相應(yīng)部位的健康皮膚組織。所有研究對(duì)象均知情同意。

采用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞并傳代增殖，對(duì)第2代細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)鑒定并采用改良有限稀釋法分離克隆。采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）法檢測克隆成纖維細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型前膠原的mRNA水平［4］。

1.2.2 PBMC的分離 無菌采集對(duì)照組和研究組病情活動(dòng)期患者各3例的靜脈血5mL，加入盛有肝素的無菌小瓶，加蓋后輕輕搖勻。取抗凝血，計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)后，采用密度梯度離心法分離PBMC，以Hanks液重懸細(xì)胞，洗滌2次后計(jì)數(shù)細(xì)胞。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將PBMC稀釋至106／mL（細(xì)胞懸液片含5μg／mL PHA），接種于25cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。離心，收集上清液。

1.2.3 PBMC對(duì)SSc皮膚克隆成纖維細(xì)胞中Ⅰ型前膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase－1，MMP－1）mRNA水平的影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定PBMC培養(yǎng)上清液的濃度為10%。在篩選出的SSc皮膚克隆成纖維細(xì)胞中，選?、裥颓澳z原mRNA高、低表達(dá)的克隆各3個(gè)，每個(gè)克隆經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，分別接種于4個(gè)3.5cm2培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至80%融合時(shí)，棄生長培養(yǎng)液，換為含0.1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，棄培養(yǎng)液，每個(gè)克隆提取其中1個(gè)培養(yǎng)皿細(xì)胞的總RNA，另外3個(gè)培養(yǎng)皿分為3組，分別為未干預(yù)組、研究組PBMC培養(yǎng)上清液干預(yù)組和對(duì)照組PBMC培養(yǎng)上清液干預(yù)組。按確定的PBMC培養(yǎng)上清液的終濃度（10%）配制含0.1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，分別加入Ⅰ型前膠原mRNA高表達(dá)和低表達(dá)的SSc皮膚克隆成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h后提取總RNA，與干預(yù)前提取的總RNA一起以實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR法檢測Ⅰ型前膠原和MMP－1mRNA水平。采用各樣品干預(yù)后與干預(yù)前目的基因mRNA的△CT的差△△CT表示干預(yù)因素的作用大?。骸鳌鰿T絕對(duì)值大，表示干預(yù)因素作用大；反之，表示干預(yù)因素作用?。弧鳌鰿T為正值，表示干預(yù)因素使目的基因mRNA的水平上升；△△CT為負(fù)值，表示干預(yù)因素使目的基因mRNA的水平下降。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。采用兩因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 篩選SSc和正常皮膚具有不同膠原合成能力的異質(zhì)性成纖維細(xì)胞克隆 研究組和對(duì)照組分別獲得36個(gè)和32個(gè)皮膚成纖維細(xì)胞的克隆，其免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：胞漿波形蛋白陽性、角蛋白陰性、Ⅷ因子陰性，符合成纖維細(xì)胞的特征。由于克隆細(xì)胞體外生存期有限，不可能對(duì)所有克隆進(jìn)行測定，因此在獲得的克隆中，檢測研究組5例共25個(gè)克隆和對(duì)照組4例共21個(gè)克隆。通過樣品聚類分析將Ⅰ型前膠原mRNA水平分為高表達(dá)（△CT＞1）、中表達(dá)（－1≤△CT≤1）和低表達(dá)（△CT＜－1），研究組高、低表達(dá)克隆數(shù)分別為12個(gè)和7個(gè)，對(duì)照組高、低表達(dá)克隆數(shù)分別為3個(gè)和5個(gè)。

2.2 PBMC對(duì)SSc皮膚克隆成纖維細(xì)胞Ⅰ型前膠原和MMP－1的mRNA水平的影響

2.2.1 PBMC對(duì)SSc皮膚克隆成纖維細(xì)胞中的Ⅰ型前膠原mRNA水平的影響 見表1。

2.2.2 PBMC對(duì)SSc皮膚克隆成纖維細(xì)胞中的MMP－1的mRNA水平的影響 見表2。

表1 PBMC對(duì)SSc患者Ⅰ型前膠原mRNA高和低表達(dá)皮膚克隆成纖維細(xì)胞Ⅰ型前膠原mRNA水平的影響（ˉx±s，△△CT）

表2 PBMC對(duì)SSc患者Ⅰ型前膠原mRNA高和低表達(dá)皮膚克隆成纖維細(xì)胞MMP－1mRNA水平的影響（ˉx±s，△△CT）

3 討 論

在SSc發(fā)病的早期，患者皮膚真皮下層存在以CD4＋T輔助細(xì)胞為主的淋巴細(xì)胞浸潤，提示免疫活性細(xì)胞可能通過直接或間接產(chǎn)生細(xì)胞因子／趨化因子來誘導(dǎo)產(chǎn)生或調(diào)節(jié)“硬皮病成纖維細(xì)胞表型”［5－6］。研究［7］顯示，SSc患者 PBMC 和皮膚 成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后，T淋巴細(xì)胞的寡克隆擴(kuò)增與發(fā)生在皮膚的T淋巴細(xì)胞寡克隆擴(kuò)增類似。

既往關(guān)于SSc患者PBMC培養(yǎng)上清與皮膚成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的研究均未考慮PBMC干預(yù)前成纖維細(xì)胞膠原合成能力對(duì)干預(yù)結(jié)果的影響，本研究以SSc皮膚克隆成纖維細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討PBMC對(duì)SSc具有不同膠原合成能力的皮膚克隆成纖維細(xì)胞的膠原代謝的影響。

本研究結(jié)果表明，SSc具有不同膠原合成能力的克隆成纖維細(xì)胞中Ⅰ型前膠原、MMP－1mRNA水平對(duì)PBMC的反應(yīng)存在異質(zhì)性。SSc患者PBMC培養(yǎng)上清與皮膚克隆成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)48h，僅使具有低膠原合成能力的SSc克隆成纖維細(xì)胞的Ⅰ型前膠原和MMP－1mRNA水平上升，未發(fā)現(xiàn)其對(duì)高表達(dá)者有影響。

［1］ Gu YS，Kong J，Cheema GS，et al.The immunobiology of systemic sclerosis［J］.Semin Arthritis Rheum，2008，38（2）：132－160.

［2］ 高地，朱鷺冰，李明.細(xì)胞因子TGFβ1，CTGF和IFN－γ對(duì)系統(tǒng)性硬皮病克隆成纖維細(xì)胞膠原代謝的影響［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志，2012，26（1）：9－11.

［3］ Subcommittee for scleroderma criteria of the American rheumatism association diagnostic and therapeutic criteria committee.Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis（scleroderma）［J］.Arthritis Rheum，1980，23（5）：581－590.

［4］ 高地，朱鷺冰，李明.系統(tǒng)性硬皮病患者皮膚克隆成纖維細(xì)胞膠原代謝的異質(zhì)性［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志，2010，24（12）：1092－1095.

［5］ Sakkas LI，Platsoucas CD.Is systemic sclerosis an antigendriven T cell disease？［J］.Arthritis Rheum，2004，50（6）：1721－1733.

［6］ Abraham DJ，Eckes B，Rajkumar V，et al.New developments in fibroblast and myofibroblast biology：implications for fibrosis and scleroderma［J］.Curr Rheumatol Rep，2007，9（2）：136－143.

［7］ De Palma R，Del Galdo F，Lupoli S，et al.Peripheral T lymphocytes from patients with early systemic sclerosis co－cultured with autologous fibroblasts undergo an oligoclonal expansion similar to that occurring in the skin［J］.Clin Exp Immunol，2006，144（1）：169－176.