蔡豐波，魏 東，張長山

SELDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)分析家族性腺瘤性息肉病血清蛋白質(zhì)譜

蔡豐波，魏 東，張長山

目的研究家族性腺瘤性息肉病患者血清蛋白質(zhì)的變化，建立靈敏度和特異度高的家族性腺瘤性息肉病診斷模型。方法 利用SELDI-TOF-MS技術(shù)對18例家族性腺瘤性息肉病患者術(shù)前、術(shù)后血清蛋白質(zhì)分別進行檢測，IMAC30芯片結(jié)合蛋白質(zhì)后，用蛋白芯片儀讀取數(shù)據(jù)，分析得到區(qū)分兩組的樹狀分類規(guī)則，并構(gòu)建診斷模型。結(jié)果M8514.89蛋白質(zhì)組成的模型可將兩組準確分組，靈敏度和特異度分別為88.89%（16／18）和100% （18／18）。結(jié)論SELDI-TOFMS技術(shù)可將家族性腺瘤性息肉病術(shù)前、術(shù)后正確分組，可應用于家族性腺瘤性息肉病的診斷、鑒別、隨訪和手術(shù)時機的選擇。

家族性腺瘤性息肉??；生物標記物；蛋白質(zhì)組學；質(zhì)譜；表面增強激光解吸離子化時間飛行質(zhì)譜

家族性腺瘤性息肉?。╢amilial adenomatous polyposis，F(xiàn)AP）是一種常染色體顯性遺傳性疾病，如不治療，其癌變率達到100%，目前尚缺乏有效的鑒別、隨訪和診斷方法。我們利用表面增強激光解吸附離子化時間飛行質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）技術(shù)研究了家族性腺瘤性息肉病患者血清蛋白質(zhì)組構(gòu)型，發(fā)現(xiàn)血清中術(shù)前組與術(shù)后組有靈敏度和特異度較高的蛋白質(zhì)將兩組準確分組，其靈敏度和特異性均在89%以上。

1 材料與方法

1.1 一般資料18例標本取自2000～2010年中國人民解放軍第150中心醫(yī)院全軍肛腸外科研究所保存的家族性腺瘤性息肉病患者術(shù)前和術(shù)后血清，各病例無其他慢性疾病史。所有病例采集空腹靜脈血3～5 m L，經(jīng)1 000 r／m in離心取上清保存于－70℃冰箱中備用。SELDI-TOF MS、IMAC30芯片購于CipherGen公司，試劑購自Sigma公司。

1.2 方法干燥管采集全血3～5 m L放于4℃冰箱，靜置3 min，4℃1 000 r／m in離心30 m in。取10 μl血清，加20μL U9緩沖液（含9 moL／L尿素，2% CHAPS，50 mmol／L Tris-HCl，pH9.0），4℃振蕩30 min，使蛋白變性；另取離心管，加10μL變性后樣品，120μL U1（9倍稀釋U9）。將芯片安裝于Bioprocessor，加入50μL 100 mmol／L硫酸銅，4℃200 r／min振蕩5 min。棄去硫酸銅，去離子水沖洗3次甩干。加入100 mmol／L醋酸鈉（pH 4.0）50μL，4℃200 r／min振蕩5 min。棄掉液體，加150μL 50 mmol／LHEPES（pH7.0）2次，棄去液體。取50μL樣品加入芯片，4℃200 r／min振蕩60 min后棄去液體，150μL的HEPES沖洗3次，棄去液體。取出芯片，自然風干，加0.5μL飽和SPA（sinapinic acid，芥子酸）2次。飛行質(zhì)譜儀讀取芯片。

1.3 統(tǒng)計學處理BioMarker Wizard軟件對蛋白質(zhì)含量進行方差分析。BioMarker Pattern軟件對數(shù)據(jù)分組及相關(guān)性進行分析［1－2］。

2 結(jié)果

2.1 軟件分析結(jié)果Biomarker W izard軟件對兩組數(shù)據(jù)進行分析，檢測到蛋白31個，其中兩組有17處蛋白存在的差異，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。用BioMarker W izard軟件和BioMarker Pattern軟件分析家族性腺瘤性息肉病術(shù)前組和術(shù)后組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)M8514.89可將兩組準確分組，產(chǎn)生終節(jié)點1和終節(jié)點2。符合M8514.89≤4.435的18例樣本歸類到終節(jié)點1，均為家族性腺瘤性息肉病術(shù)后組樣本；滿足M8514.89＞4.435樣本歸類于節(jié)點2均為家族性腺瘤性息肉病術(shù)前組樣本。術(shù)前術(shù)后兩組的M8514.89的平均值分別為10.37和2.08，其標準差分別為2.72和1.24。錯誤分組率3.70%。

2.2 分組準確率以蛋白質(zhì)M8514.89所形成的分組模型，16／18家族性腺瘤性息肉病術(shù)前組和18／18術(shù)后組被準確分組，準確率為94.44%（34／36）。16／18家族性腺瘤性息肉病術(shù)前組和18／18術(shù)后組被準確分組，靈敏度88.89%（16／18），特異度100% （18／18）。

3 討論

家族性腺瘤性息肉?。‵AP）約占大腸癌的1%以下，多數(shù)具有出血、腹瀉、黏液便等腸道癥狀，部分患者具有腸道外表現(xiàn)為Gardner綜合征，或具有Turcot綜合征，家族性腺瘤性息肉病常同時伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤。1991年分離出APC （adenomatous polyposis coli）基因，其位于常染色體5q21，產(chǎn)物是由GSK-3β、β-catenin和axin組成的復合物。目前研究證實Wnt信號蛋白與APC密切相關(guān)，Wnt的基因產(chǎn)物是始終存在于機體中的調(diào)節(jié)組織發(fā)展的信號分子。APC基因突變導致Wnt表達產(chǎn)物持續(xù)異常升高，引起細胞過度增殖并最終導致腫瘤形成。Elias Gounaris等研究結(jié)果顯示，在小鼠中不僅APC基因在FAP發(fā)病過程中起重要作用，間質(zhì)環(huán)境，特別是肥大細胞，對于FAP的發(fā)病具有重要作用。通過消除肥大細胞的功能，息肉病能夠有較大的緩解［3］。Anthony tighe等研究提示GSK-3抑制劑能夠減少FAP治療過程中不必要的常染色體不穩(wěn)定性［4］。目前研究表明FAP的基因基礎主要為APC 和MYH兩種基因變異。

目前FAP診治中仍有一些疑難問題存在：①FAP的早期病例發(fā)現(xiàn)十分困難，多數(shù)因有腸道癥狀而就診，并因腸鏡而發(fā)現(xiàn)，而此時多數(shù)已有癌變發(fā)生；②多發(fā)性腺瘤性息肉與FAP的鑒別診斷相當困難，多數(shù)FAP腸道外癥狀并不典型，家族史也多缺失；③早期FAP判斷困難，行預防性腸切除手術(shù)時機較難準確把握，多數(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)即行限期手術(shù)。因此早期發(fā)現(xiàn)FAP患者，同時進一步完善診斷標準包括早期FAP的診斷標準，以及手術(shù)時機的選擇是目前FAP研究的難點問題。我們應用SELDI技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)M8514.89可將FAP術(shù)前組和術(shù)后組準確分組，其平均值分別為10.37和2.08，P＜0.01。16／18家族性腺瘤性息肉病術(shù)前組和18／18術(shù)后組被準確分組，靈敏度88.89%（16／18），特異度100%（18／18）。

通過本實驗，我們認為SELDI-TOFMS方法能夠較靈敏和特異地發(fā)現(xiàn)FAP患者術(shù)前術(shù)后的血清變化，其靈敏度和特異度均較為滿意，同時其差異蛋白術(shù)前組術(shù)后組表現(xiàn)有升有降，可能與腫瘤本身表達的蛋白、手術(shù)刺激引起機體的應激蛋白表達、肥大細胞等分泌的炎癥因子等因素有關(guān)，這些尚有待進一步研究。

［1］ 高春芳，趙光，鄭國寶，等.利用血清中蛋白質(zhì)組構(gòu)型鑒定Dukes A期結(jié)直腸癌［J］.解放軍醫(yī)學雜志，2005，30（6）：460－462.

［2］ 趙光，高春芳.血清中蛋白質(zhì)組構(gòu)型對結(jié)直腸癌的診斷意義［J］.癌癥，2004，23（6）：614－618.

［3］Elias Gounaris，Susan E.Erdman，et al.Mast cells are an essential hematopoietic component for polyp development［J］.PNAS，2007，104：1997，7－19982.

［4］Anthony tighe，Arpita Ray-Sinha，et al.GSK-3 inhibitors induce chromosome instability［J］.BMC Cell Biology，2007，8：34.

Analysis of Proteom ics Spectra in Serum from Patients With FAP by SELDI-TOF Mass Spectrom etry

CAI Feng-bo，WEIDong，ZHANG Chang-shan
（PLA NO.150 Hospital，Luoyang 471031，China）

ObjectiveTo research the serum protein of FAP patients，and establish the diagnostic model of FAP with high sensitivity and specificity in application.MethodsSamples of sera with 18 preoperative and postoperative FAP patients were detected by surface enhanced laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry SELDI-TOF MS.After the surface of chips IMAC30 bind the serum protein，proteinchip reader of ciphergen inc，a part of SELDI-TOFMS，would detect the signs.Then the classification rule of tree was discoverer.The model of identification of FAP would be constructed by the classification rule of tree.ResultsAt the key M／Z values of M8514.89 protein contents of the two classes are obviously different by the software analysis.And corresponding sensitivity was 88.89%（16／18）and corresponding specificity was 100%（18／18）.ConclusionTHE SELDI-TOFMS could be used in the diagnosis，identification，followup and operative juncture of FAP.

adenomatous polyposis coli；biomarkers；proteomics；mass spectrometry，SELDI-TOF MS

R735.3＋4

A

1672－688X（2012）04－0251－02

2012－09－01

中國人民解放軍第150中心醫(yī)院，河南洛陽471031

蔡豐波（1980－），男，河南伊川人，主治醫(yī)師，從事肛腸外科臨床及研究工作。