李富威，高 琴，張舒亞，*，諶鴻超，包建強，郭云霞

（1.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135;2.上海海洋大學食品學院，上海 201306)

實時熒光PCR方法在食品真?zhèn)伪鎰e中的應用

李富威1，2，高 琴1，張舒亞1，*，諶鴻超1，包建強2，郭云霞2

（1.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135;2.上海海洋大學食品學院，上海 201306)

實時熒光PCR技術以其特異性、靈敏性、簡便、快速的優(yōu)點，廣泛應用于食品鑒偽檢測。本文闡述了實時熒光PCR的原理以及其在肉制品、高價值食品、乳制品、果汁、水產品和油脂鑒偽檢測方面的應用情況。

食品，真?zhèn)舞b別，實時熒光PCR

食品加工技術的不斷發(fā)展為人們提供越來越多的品種、口味和形態(tài)各異的食品。隨著中國經濟的全面發(fā)展，人們的消費觀念不斷發(fā)生變化，對食品的要求不僅是結構的多樣性，而且日益注重食品的質量。近年來，在國內外市場上出現(xiàn)了許多摻假、摻雜、偽造食品。食品摻假指食品中非法摻入外觀、物理性狀或形態(tài)相似的非同種類物質，如蜂蜜中加入轉化糖，藕粉中混入薯粉;食品摻雜指在食品中非法摻入一些雜物，比如一些非同一種類或同種類劣質物質，糧食中摻入沙石，牛肉中摻入馬肉等;食品偽造指包裝標識或產品說明與內裝食品的種類、品質、營養(yǎng)成分名不副實的假冒做法，如假燕窩、假魚翅、假乳粉、假人參、假鹿茸等[1]。這些不法行為不僅直接損害了消費者的經濟利益，而且極有可能因為某些過敏原或有害成分的引入，危害消費者健康，因此加強打假的力度刻不容緩，這就需要不斷提高食品檢測技術，來鑒別摻雜、造假的食品。近年來，隨著生物新技術發(fā)展，食品鑒別的技術發(fā)展也突飛猛進，有關PCR技術鑒別食品真?zhèn)蔚难芯砍试鲩L趨勢。實時熒光PCR以其高特異性、靈敏性、可定量、無污染等優(yōu)點，得到了廣泛的關注，越來越多的被用于食品的檢測。本文主要對近年來有關實時熒光PCR在食品真?zhèn)伪鎰e中應用的研究報道進行綜述。

1 實時熒光PCR方法原理

所謂的實時熒光PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時檢測[1]，實現(xiàn)對起始模板定性及定量的分析。在實時熒光PCR反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖[2]。

實時熒光PCR類型主要有特異性熒光探針類和嵌入熒光染料類兩種。特異性熒光探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物增加，如TaqMan探針、Light Cycler雙探針;嵌入熒光染料類是利用染料與雙鏈DNA小溝結合發(fā)光來指示擴增產物的增加，常用的有SYBR、Eva green染料等。

2 實時熒光PCR方法優(yōu)缺點

實時熒光PCR方法自動化程度高、靈敏度高，同時通過光學系統(tǒng)檢測熒光信號而省去了凝膠電泳的繁瑣操作，減少了假陽性的發(fā)生率，避免了實驗過程中染色劑溴化乙錠對人體的潛在危害。另外，實時熒光PCR也有其不足之處：熒光染料類實時熒光PCR由于熒光染料可以和任何雙鏈DNA結合，因此DNA引物二聚體或其他非特異擴增產物會對定量結果產生干擾，降低了反應的專一性和可重復性。

3 實時熒光PCR在食品真?zhèn)伪鎰e中的應用

3.1 肉類及其制品鑒偽

肉類是百姓生活的必需品。目前，國內市場上在肉和肉制品的生產與銷售中，利用摻雜造假、以次充好等手段欺騙消費者。摻雜造假的手段包括混入，假冒，以病死畜禽肉充當好肉，以不新鮮肉充當新鮮肉，以低價肉充當高價肉，肉注水，粉飾，香腸中食用過量淀粉等[3]。其中，尤以摻雜異種肉等造假行為較為常見。這不僅僅涉及經濟、營養(yǎng)價值和食品安全等問題，更直接影響著消費者的健康。因此，對食品中原料肉進行物種鑒定顯得十分必要，要檢測出肉制品中肉的組成比較困難，PCR方法由于其反應時間短，具有較高靈敏性、特異性和可鑒別性，成為物種鑒別中最常用的方法[4-5]。而新興的實時熒光定量PCR技術可以精確地對DNA進行定性定量分析。

張宏偉等用PCR和實時熒光PCR方法檢測食物中豬成分，依據豬線粒體DNA中的細胞色素b基因序列設計一對特異性引物，用于檢測食物中的豬源成分[6]。Jason Sawyer等采用通用引物，物種特異引物和實時熒光定量PCR技術分析出在牛羊混合物中牛肉的摻入量;首先測定出一系列已知牛肉含量的標準曲線，再對未知樣品進行熒光PCR擴增，將結果與標準曲線進行對比，檢測出2%的牛肉摻入量[7]。Chun-Lai Zhang根據牛線粒體的cytb基因序列設計了一對特異性引物及探針，建立了實時PCR檢測方法，可檢出35pg DNA的牛樣品，和綿羊、山羊、豬樣品無交叉反應，運用此方法有效的從新鮮肉及加工肉檢測到牛的DNA[8]。Miguel A.Rodríguez通過實時PCR擴增12S rRNA基因，擴增長度425～428bp，有效地分析出混合肉中豬肉的摻入量[9]。Fajardo V用實時PCR方法檢測混合肉中鹿成分[10]。Kêppel R等建立了實時定量PCR檢測食物中的豬肉、雞肉、羊肉、馬肉成分[11]。J.Chisholm等報道了用實時PCR方法檢測肉中馬肉和驢肉成分[12]。John JDooley等進行了實時熒光PCR鑒別牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和火雞肉的研究[13]。

3.2 高價值食品鑒偽

隨著生活水平的提高，人們對高營養(yǎng)價值和高經濟價值的保健產品需求日益增長，供不應求，因此市場上假冒偽劣產品很多，如假冬蟲夏草、假人參、假燕窩、假鹿茸等。高價值品的鑒偽方法較多，早期的鑒別研究多采用性狀鑒別、顯微鑒別及簡單的理化鑒別，但存在鑒別結果可靠性不高等問題，實時熒光PCR方法應用于高價值食品的真?zhèn)舞b別，準確性高、實用性強。

Yajun Wu等運用SYBR GreenⅠ熒光 PCR快速檢測燕窩制品中燕窩成分，可檢測到0.5%的燕窩和銀耳混合物[14]。陳穎等建立了實時熒光PCR鑒別魚翅的方法，能夠簡單、快速、特異且靈敏地鑒別魚翅的真?zhèn)蝃15]。馬駿等公開了運用實時熒光PCR鑒別及檢測冬蟲夏草的方法，除了能定性鑒別冬蟲夏草的真?zhèn)瓮?，還能檢測樣品中冬蟲夏草的含量，其檢測限量可低至0.0001ng/μL，比現(xiàn)有技術更加靈敏[16]。陳穎等建立了馬鹿茸、梅花鹿茸真?zhèn)舞b別的實時熒光PCR檢測方法[17-18]。徐君怡等針對虎線粒體細胞色素b（cytb)基因設計特異性引物，建立并優(yōu)化SYBR GreenⅠ熒光PCR檢測鑒定體系，檢測靈敏度可達到在骨粉中檢出質量分數(shù)為0.05%的虎源性成分，SYBR GreenⅠ實時定量PCR方法具有方便、經濟、靈敏度高和重復性好等特性，可用于虎制品的檢測鑒定[19]。徐君怡等建立SYBR GreenⅠ實時熒光PCR檢測鑒定獅制品的方法，檢測出10pg/μL的獅組分DNA，抗干擾能力顯示在骨粉中獅的成分最低檢出含量為0.1%[20]。

3.3 乳及乳制品鑒偽

牛奶因其良好的營養(yǎng)功效備受國內外消費者的青睞，然而伴隨著乳品加工行業(yè)的迅猛發(fā)展，在巨大經濟利益的驅使下，乳品的摻假現(xiàn)象越來越嚴重。摻偽方式有摻水增加奶液體積，摻入物理、化學性質相近物質及液體，以次充好[3]。就世界范圍的牛奶摻假檢測而言，傳統(tǒng)的化學分析方法在現(xiàn)階段仍占主導地位，現(xiàn)在的食品摻偽水平和手段越來越高明，使一些檢測鑒別摻偽的傳統(tǒng)方法已越來越不能滿足日益發(fā)展的社會需求[21-22]。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，以DNA為基礎的檢測方法和手段越來越多的應用于食品檢測中。加工食品原材料成分復雜，且大部分加工食品都經過了高溫加熱的過程，導致蛋白質變性，生物酶失活，無法作為檢測指標，而PCR檢測的檢測對象是脫氧核酸（DNA)，在深加工食品中仍有核酸的存在，因此，PCR檢測法不受材料的限制，可以應用于深加工食品的檢測。

岳巧云等建立了利用實時熒光PCR方法，以大豆內源參照基因lectin為指標，對奶粉中摻入豆粉等植物成分進行定性、定量分析的方法[23]。Chun-Lai Zhang等建立了牛奶及奶酪中牛成分的實時PCR檢測方法[8]。López-Calleja等依據12S rRNA基因序列設計了實時PCR引物，從牛奶和羊奶的混合物中有效地檢出牛奶成分，特異性和靈敏度高[24]。López-Calleja等建立了實時PCR在綿羊奶混合物中成功檢出山羊奶[25]。Alba N Mininni等用實時熒光PCR檢出綿羊和山羊奶中的牛奶成分[26]。

3.4 果汁及飲料鑒偽

近年來，果汁消費量的速度急劇增加，由于果汁是以水果為原料生產的，其產量受多種因素的影響，往往價格較高。受經濟利益的驅使，一些不法生產者往往采用各種手段向市場提供各種摻假果汁。按照果汁的定義，除以濃縮果汁為原料生產還原果汁時可添加與果汁濃縮時失去的天然水分等量的水外，果汁類產品是不允許添加任何外來物質的。因此，任何添加了外來物質的果汁，都認為是摻假果汁。果汁和果汁飲料的摻假嚴重損害了消費者的利益，應重視摻偽果汁檢測技術的研究。果汁鑒偽一直基于感官、理化等方法進行檢測分析，現(xiàn)代生物技術的發(fā)展和應用，給果汁鑒偽研究注入新的血液，具有方便、準確、迅速、簡潔的特點，能夠準確無誤地從基因水平分析果汁的品種和來源，其結果為證明果汁的真?zhèn)翁峁┝丝煽康囊罁27-28]。目前，很多研究機構將PCR技術應用于果汁的摻偽鑒別和質量控制中。

Morton等用PCR技術鑒別蘋果品種，為利用PCR技術進行蘋果汁的鑒偽奠定研究基礎[29]。韓建勛等建立了梨成分的實時熒光PCR檢測方法，該方法能夠有效檢測到果汁中的梨成分，具有特異性強，靈敏度高等優(yōu)點，可應用于果汁或食品中梨成分的鑒別[30]。Palmieri L.等報道根據5S rRNA基因序列和ANS（anthocyanidin synthase)序列設計特異性引物，用實時熒光PCR方法檢測食品中的桔子、菠蘿、藍莓、草莓成分[31]。

3.5 水產品鑒偽

近年來對水產品的消費逐漸上升，一些不法商販在水產品加工中摻假造假，以低價水產品代替高價水產品出售，一方面大大損害了消費者的利益，另一方面也造成了不正當?shù)纳虡I(yè)競爭。在水產品加工中，物種的原始可識別形態(tài)特征消失，這使得物種的鑒別變得相對困難。研究人員開始用實時熒光PCR方法對水產品進行物種鑒定，這為判定水產品摻雜造假提供了技術支持。

Beatriz Herrero等運用TaqMan實時熒光PCR方法檢測和鑒定大西洋鮭，實驗結果顯示大西洋鮭的Ct值為12±2其他物種樣品Ct值大于27，該方法可用于新鮮，冷凍，加工過的魚產品的檢測[32]。A.Sa′nchez等進行了TaqMan實時熒光PCR鑒定歐洲無須鱈的研究，結果表明此方法快速準確[33]。Beatriz Herrero等用TaqMan實時熒光PCR檢測和識別大西洋鱈魚，該方法可以應用于各類產品，新鮮、冷藏、加工的產品，包括那些經深加工的產品[34]。鶴田小百合等根據cytb基因設計了特異性引物，建立了TaqMan實時熒光PCR檢測和鑒定太平洋鱈，阿拉斯加狹鱈，毛鱗魚的方法[35]。Martin I.Taylor等建立了TaqMan實時熒光PCR同時鑒定大西洋鱈，黑線鱈和牙鱈的方法[36]。Itziar Lopez等用TaqMan實時熒光PCR方法對黃鰭金槍魚和長鰭金槍魚進行定性和定量的研究[37]。

3.6 油脂鑒偽

目前我國食用油脂摻假現(xiàn)象仍很常見，嚴重影響人民身體健康，是油脂食品安全問題重中之重。食用油脂的摻偽現(xiàn)象主要表現(xiàn)為未精煉的機榨及變質油，不同油脂勾兌，在食用油中摻入非食用油脂，用煎炸餐飲殘油替代食用油脂，地溝油回收使用，動物油脂的非法回收使用等[3]。食用油摻假摻雜不僅威脅著人們的身體健康，而且侵犯消費者利益，影響消費信心，不利于食用油產業(yè)的健康發(fā)展。運用分子生物學技術對食用油進行品種鑒定及摻假檢測是新發(fā)展起來的一種檢測方法，與傳統(tǒng)方法的理化檢測和儀器分析檢測相比（如測定過氧化值、脂肪酸比例，色譜分析等)，具有檢測靈敏度高，可靠性強，操作簡單和省時省力等優(yōu)點[38-39]。

覃文等采用實時熒光PCR技術，通過檢測花生的種屬特異性基因片段，定性檢測市售食用混合油脂中的花生油成分，并對其中花生油的含量檢測進行了探索研究。結果表明，食用油脂中可提取出用于定性定量PCR的DNA，花生的Arah1基因是具有花生種屬特異性的基因，采用實時熒光PCR方法檢測Arah1基因片段可定性定量檢測混合食用油脂中的花生油成分，為定性定量檢測混合食用油中其他組分提供了技術平臺[40]。欒鳳俠等用實時熒光PCR技術成功地檢測出了食用油脂中的內源基因和外源基因[41]。然而，由于油脂的DNA極易破壞和斷裂，所以對于精煉油的PCR檢測較難。

4 結論

近年來，市場上食品摻偽造假的現(xiàn)象十分嚴重，為了保護消費者利益和維護市場秩序，食品摻偽檢測的重要性顯而易見。現(xiàn)在的食品摻偽水平和手段越來越高明，仿真度極高的劣質產品給檢驗工作帶來了巨大的挑戰(zhàn)，使許多檢測鑒別摻偽的傳統(tǒng)方法已無法測定。實時熒光PCR技術從基因水平分析食品原料和產品的特性，為證明食品的真?zhèn)翁峁┝丝煽康囊罁Ｔ摷夹g以其高準確度、高精確度的優(yōu)點將取得更快更好的發(fā)展。本領域應致力于解決當前實時熒光PCR技術中存在的一些問題，推動該技術在食品檢測及其他領域的應用和普及。

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Application of real-time fluorescent PCR in detection of food authenticity

LI Fu-wei1，2，GAO Qin1，ZHANG Shu-ya1，*，CHEN Hong-chao1，BAO Jian-qiang2，GUO Yun-xia2
（1.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine，Shanghai 200135，China;2.College of Food and Technology，Shanghai University，Shanghai 201306，China)

Real-time Fluorescent PCR which has the character of differential，sensitive，convenient and fast virtues，has been used in detection of food authenticity.The principle of real-time fluorescent PCR was discussed and expatiated its application in detection of meat products，high value food，dairy product，fruit juice，aquatic products and edible oils.

food;authentication;real-time fluorescent PCR

TS201.1

A

1002-0306（2012)14-0367-04

2011－11－18 *通訊聯(lián)系人

李富威（1985-)，女，碩士研究生，主要從事食品保鮮及分子生物學檢測技術研究。

上海出入境檢驗檢疫局科研項目（HK002-2012)。