陳 斌

利川市人民醫(yī)院康復(fù)科(湖北 利川 445400)

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人類正從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(Structural genomics)進(jìn)入功能基因(Functional genomics)和功能蛋白質(zhì)組(Functional proteomics)時(shí)代[1]，也促進(jìn)了基因芯片技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)等與中醫(yī)藥研究有關(guān)的高新技術(shù)的發(fā)展。其中，基因芯片技術(shù)以高通量、高集成、多樣化和自動(dòng)化等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥各領(lǐng)域的研究中?，F(xiàn)對(duì)基因芯片技術(shù)在中醫(yī)“證侯”、中藥和針刺機(jī)制研究中的應(yīng)用取得的一些成果進(jìn)行綜述。

1 基因芯片技術(shù)

基因芯片(genechip)(又稱DNA芯片、生物芯片)是根據(jù)核酸互補(bǔ)雜交原理而研制出來(lái)的[2]。基因芯片的測(cè)序原理是雜交測(cè)序方法，即通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，在固相支持物表面固定序列已知的核苷酸的分子探針，組成微陣列，利用核酸雜交原理，然后進(jìn)行熒光共聚焦檢測(cè)，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件比較和統(tǒng)計(jì)分析后，可對(duì)大量基因的表達(dá)水平、突變和多態(tài)性進(jìn)行快速、并行、準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)分析[3]。且一塊芯片一次雜交可以對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，形成完整的基因表達(dá)譜，目前已成為基因表達(dá)分析的最常用的工具[4]。

近年來(lái),基因芯片技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于中醫(yī)藥研究各領(lǐng)域，主要體現(xiàn)在中醫(yī)中證候研究、中藥作用機(jī)理研究、中藥有效成分篩選、中藥藥材鑒定及探索針刺作用機(jī)制等方面，并取得了一定成果。

2 基因芯片技術(shù)在中醫(yī)“證”研究中的應(yīng)用

辨證論治是中醫(yī)診斷和治療疾病的主要手段之一，辯證是論治的前提，所以證是中醫(yī)學(xué)中的重點(diǎn)、難點(diǎn)和熱點(diǎn)。所謂證是指在疾病發(fā)展過(guò)程中，某一階段的病理概括，它包括原因、病的部位、病的性質(zhì)、和邪正關(guān)系，反映了疾病發(fā)展過(guò)程中，該階段病理變化的全面情況[5]。但證的本質(zhì)研究一直未取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，因?yàn)楹?jiǎn)單的證，也會(huì)影響到人體全身各個(gè)系統(tǒng)、組織及細(xì)胞，引起非常復(fù)雜的變化。

建立中醫(yī)“證”的基因表達(dá)譜，將是21世紀(jì)中醫(yī)藥學(xué)的主要發(fā)展趨勢(shì)[6]。利用基因芯片的多態(tài)性表達(dá)技術(shù)，對(duì)用傳統(tǒng)中醫(yī)方法確診的證進(jìn)行基因表達(dá)譜的建立，推斷表達(dá)譜基因的相互關(guān)系，揭示證與基因的實(shí)質(zhì)關(guān)系，有可能從分子水平揭示證的本質(zhì)。柴可夫等[7]用基因芯片檢測(cè)2型糖尿病中醫(yī)濕熱困脾證的基因表達(dá),通過(guò)基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其和健康人表達(dá)差異的基因共38條，其中上調(diào)的基因有24條，下調(diào)的基因有14條。并發(fā)現(xiàn)濕熱困脾證的特異性基因。潘志強(qiáng)等[8]用基因芯片檢測(cè)肝癌小鼠早期邪毒壅盛證和氣虛證、中期陽(yáng)氣虛證、中晚期氣陰陽(yáng)虛證三個(gè)階段4個(gè)征候腎上腺素基因表達(dá)的差異，結(jié)果篩選到不同階段一致上調(diào)的基因73個(gè)，一致下調(diào)的基因26個(gè)。吳遠(yuǎn)勝等[9]用基因芯片技術(shù)對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者基因差異表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)分析，共發(fā)現(xiàn)了16大類580條基因有顯著差異表達(dá)，其中熱毒熾盛型和陰虛內(nèi)熱型大部分基因與代謝相關(guān)的基因表達(dá)有一致性。倪紅梅等[10]基因芯片技術(shù)術(shù)篩選，分析青少年腎陽(yáng)虛體質(zhì)者外周血白細(xì)胞的差異表達(dá)基因，共篩選出127條符合標(biāo)準(zhǔn)的差異表達(dá)基因，其中63條呈上調(diào)表達(dá)，64條呈下調(diào)表達(dá)。與青少年腎陽(yáng)虛體質(zhì)相關(guān)的基因表達(dá)涉及到免疫相關(guān)、發(fā)育相關(guān)、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞受體、細(xì)胞信號(hào)和傳遞蛋白、蛋白翻譯合成等，其中，CCNH基因與PSMB7基因的表達(dá)差異最大，提示這兩條基因可能與青少年腎陽(yáng)虛體質(zhì)密切相關(guān)。這些均說(shuō)明基因表達(dá)差異與證候是有關(guān)聯(lián)的。

3 基因芯片技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用

3.1中藥作用機(jī)理研究由于化學(xué)藥品毒副作用的不斷增強(qiáng)，人們把眼光也逐漸轉(zhuǎn)向了天然的中藥藥物治療。因其缺乏科學(xué)的理論支持，中藥復(fù)雜的作用機(jī)制至今仍是中藥國(guó)際化的瓶頸?；蛐酒夹g(shù)以其高通量、并行、高內(nèi)涵的優(yōu)勢(shì)為探索中藥作用機(jī)理等現(xiàn)代中藥研究開(kāi)辟了嶄新的領(lǐng)域[11]。利用基因芯片確定靶組織的基因表達(dá)模式，可將中藥作用的所有靶基因全部顯示出來(lái)，從而為揭開(kāi)中藥作用機(jī)制提供了有效的依據(jù)。于華蕓等[12]利用基因芯片技術(shù)探討寒性中藥大黃清熱瀉火解毒的作用機(jī)制。通過(guò)基因表達(dá)譜結(jié)果與生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)大黃組與正常對(duì)照組比較有398條基因差異表達(dá)。并發(fā)現(xiàn)2個(gè)顯著性基因功能亞類：防御反應(yīng)，涉及21條差異基因；脂代謝過(guò)程，涉及11條差異基因，主要參與花生四烯酸代謝過(guò)程。調(diào)控機(jī)體防御反應(yīng)、花生四烯酸代謝相關(guān)基因表達(dá)，可能是大黃發(fā)揮清熱瀉火解毒作用的分子機(jī)制之一。祁冰等[13]應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析丹參提取物——隱丹參酮對(duì)胰島素抵抗卵巢顆粒細(xì)胞基因表達(dá)的影響，共篩查出42個(gè)差異基因，其中22個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，20個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。研究表明，隱丹參酮可以通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)基因、作用多個(gè)信號(hào)途徑來(lái)改善胰島素抵抗卵巢顆粒細(xì)胞的狀態(tài)。

3.2中藥有效成分的篩選中藥的有效成分及其作用機(jī)制非常復(fù)雜，不管是單方和復(fù)方。由于技術(shù)手段的限制，傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法提取出來(lái)的中藥成分的藥理作用不明，而且利用傳統(tǒng)的藥理篩選方法來(lái)篩選中藥的有效成分，耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大、效率低，研究經(jīng)費(fèi)高。如果利用基因芯片的高通量、平行快速檢測(cè)的特點(diǎn)來(lái)篩選中藥的有效成分，可避免大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，縮短藥物篩選所需要的時(shí)間和周期，節(jié)約實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。利用基因芯片技術(shù)對(duì)中藥或者中藥某些成分進(jìn)行分析，可將中藥的成分與基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)，通過(guò)分析比較不同藥物成分對(duì)基因表達(dá)譜的 影響，確定發(fā)揮藥效的部分。據(jù)報(bào)道，香港科技大學(xué)生物技術(shù)研究所利用基因芯片技術(shù)已經(jīng)篩選到知母的23種有效成分[14]。Hara等[15]利用基因芯片分析抗腫瘤草藥黃連根及其8個(gè)組成分子的12600個(gè)基因，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)處理，已經(jīng)確定黃連中抗增殖的有效成分是黃連素。

3.3中藥藥材鑒定準(zhǔn)確地鑒定中藥藥材是保證中藥臨床用藥安全準(zhǔn)確有效的前提。我們過(guò)去常依據(jù)藥物的來(lái)源、性質(zhì)等基本特征進(jìn)行鑒定，但各有局限性，因而難于滿足中藥鑒別的需要。有學(xué)者提出利用生物芯片技術(shù)可對(duì)中藥的基因進(jìn)行鑒定。應(yīng)用基因芯片技術(shù)可實(shí)現(xiàn)中藥品種快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化鑒定，保證臨床用藥的安全性與有效性。如果將中藥材某些特異基因測(cè)序完成后，可將各種中藥材的特異基因的特異核苷酸序列探針做成基因芯片，就可以非常準(zhǔn)確地鑒別藥材的真?zhèn)?。Zhang YB等[16]利用基因芯片技術(shù)對(duì)中藥石斛的不同種屬進(jìn)行了鑒別，將16個(gè)不同種屬石斛的ITS1-5．8S．ITS2序列固定于玻片上制作了基因芯片，并用熒光標(biāo)記的ITS2序列作為探針，可檢測(cè)出5種被記載的石斛。

4 基因芯片技術(shù)在針刺研究中的應(yīng)用

隨著針灸的不斷發(fā)展，其作用機(jī)制成為近來(lái)研究的熱點(diǎn)，揭示針刺作用機(jī)制能夠更好的提高其臨床療效。針灸作用于人體后，能引起人體神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫，消化等多個(gè)系統(tǒng)的反應(yīng)，但針灸的信號(hào)是如何在細(xì)胞內(nèi)外傳遞的過(guò)程仍不清楚；此外，不同的針刺條件，比如不同的頻率、幅度、時(shí)間，強(qiáng)度等會(huì)產(chǎn)生不同的療效。針刺作用機(jī)制的研究一直沒(méi)有太大的進(jìn)展，如果利用基因芯技術(shù)可檢測(cè)針刺時(shí)細(xì)胞內(nèi)外基因表達(dá)的差異，再利用蛋白組學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù)進(jìn)行分析，有可能揭示針刺作用機(jī)制。楊麗萍等[17]用基因芯片技術(shù)檢測(cè)腎陽(yáng)虛證骨關(guān)節(jié)炎患者及壓正常人的基因表達(dá)譜，以及針灸治療顯效者的治療前后基因表達(dá)譜的變化。結(jié)果篩選出與腎陽(yáng)虛骨關(guān)節(jié)炎免疫相關(guān)的基因13條，腎陽(yáng)虛骨關(guān)節(jié)炎患者與正常人相比表達(dá)下調(diào)4條，上調(diào)5條。通過(guò)對(duì)13條免疫相關(guān)基因的功能分析，初步認(rèn)為腎陽(yáng)虛骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生涉及多種免疫相關(guān)基因，溫針灸可能是通過(guò)調(diào)控多基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)其治療作用。王米渠等[18]應(yīng)用基因芯片研究針刺涌泉穴對(duì)D一半乳糖所致衰老大鼠基因表達(dá)的影響，初步篩選出了差異表達(dá)基因318條，其中表達(dá)上調(diào)的有137條，表達(dá)下調(diào)的有181條，并對(duì)其中差異最為顯著的55條作了初步分析。針刺涌泉穴對(duì)衰老大鼠的基因表達(dá)的影響涉及免疫、生長(zhǎng)發(fā)育、基礎(chǔ)代謝和細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)等多個(gè)方面，這從基因水平證明了針刺治療是一整體調(diào)節(jié)作用。

5 結(jié)論

基因芯片技術(shù)以其自身的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥各領(lǐng)域的研究中，它使中醫(yī)藥的發(fā)展和研究更加現(xiàn)代化、標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化，準(zhǔn)確化。雖然基因芯片技術(shù)費(fèi)用相對(duì)昂貴，技術(shù)手段還處于探索研究階段，部分芯片特異性、敏感度相對(duì)較低等因素局限了其在中醫(yī)藥各領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展，但其在中醫(yī)證基因表達(dá)差異分析、中藥作用機(jī)制、中藥篩選及針刺機(jī)制研究等方面已發(fā)揮出重大作用，為我們更好地研究祖國(guó)醫(yī)藥開(kāi)辟了一條新的道路，所以仍有廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。隨 著生物信息學(xué)的發(fā)展，基因芯片技術(shù)會(huì)在生命科學(xué)研究的更多方面顯示出它的價(jià)值，也會(huì)更好的促進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展。

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