張雙林，孫明飛，宋言崢

（1.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胸心血管外科，河南 開(kāi)封 475000；2.復(fù)旦大學(xué) 附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 200540）

肺癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，發(fā)病率在世界各國(guó)呈上升趨勢(shì)，其病死率位居惡性腫瘤首位。由于HIV傳播及抗生素耐藥率不斷上升，肺結(jié)核病在全球死灰復(fù)燃。肺結(jié)核、肺癌都屬于呼吸系統(tǒng)疾病，具有相似的臨床癥狀。目前，肺結(jié)核特別是菌陰肺結(jié)核與肺癌的鑒別診斷仍是一大難題。現(xiàn)有的鑒別診斷方法很多，但效果不一，都存在局限性。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)及其發(fā)展為2種疾病的診斷標(biāo)志物的研究提供了新的方法及思路，未來(lái)可能為2種疾病的診斷及鑒別診斷提供新的技術(shù)手段。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)概念及研究?jī)?nèi)容

1994年澳大利亞的 Wikins和 Williams［1］在意大利提出了蛋白質(zhì)組（proteome）這一概念，其意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)，即包括一種細(xì)胞、一種組織全部蛋白質(zhì)”。它的最大優(yōu)勢(shì)是可以在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，觀(guān)察一個(gè)完整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞型在特定的時(shí)間下，生理或病理狀態(tài)中所發(fā)生的相應(yīng)的變化［2］。近年來(lái)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)一批有價(jià)值的潛在標(biāo)志物，為疾病的診斷和治療開(kāi)辟了新的途徑［3-4］。

蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容是：①表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)：即研究蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)與量的變化，以及對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜的分析研究。②功能蛋白質(zhì)組學(xué)：即研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的行為、運(yùn)輸以及蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。③結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)：為了闡述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，而出現(xiàn)的一種全景式的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，可獲得有機(jī)體生命活動(dòng)的全景式認(rèn)識(shí)。蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究能更深入地了解疾病發(fā)生的分子機(jī)制，同時(shí)也能為疾病的預(yù)防、臨床診斷及治療提供新思路。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)常用技術(shù)

2.1 蛋白質(zhì)樣品制備

蛋白質(zhì)樣品制備至今沒(méi)有一個(gè)通用的技術(shù)。在制備樣品時(shí)，首先要明確實(shí)驗(yàn)的最終目的，然后結(jié)合實(shí)驗(yàn)積累的經(jīng)驗(yàn)來(lái)選取制備方法。

蛋白質(zhì)樣品制備的原則：①制備的樣品要全部處于溶解狀態(tài)。②在制備樣品時(shí)防止發(fā)生聚集、沉淀。③完全去除干擾蛋白（高豐度及無(wú)關(guān)蛋白）。④制備方法要具有可重復(fù)性。而制備蛋白質(zhì)樣品的同時(shí)要特別注意去除高豐度蛋白（血清蛋白、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、珠蛋白、脂蛋白等）［5］。去除高豐度蛋白方法很多，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x取。例如：親和層析技術(shù)［6］、沉淀法［7］、超濾離心法［8］、等電捕捉法［9］、液相色 譜法［10］等。而理想的去除高豐度蛋白的方法是：既能最大限度地去除高豐度蛋白又能避免影響低豐度蛋白。因此，要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)及其目的選擇不同的方法。

2.2 雙向凝膠電泳（two－dimensional gel electrophoresis，2－DE）

雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的經(jīng)典方法之一。1975年，O’Farrell［11］首次建立等電聚焦／SDS－聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳（IEF／SDS－PAGE）的模式，其基本原理為，第一向電泳：蛋白質(zhì)在pH梯度內(nèi)按照它們等電點(diǎn)的不同進(jìn)行分離；第二向電泳：在垂直方向上按照蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行SDSPAGE電泳分離。直到20世紀(jì)80年代中期出現(xiàn)了“固相pH梯度”，克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移、梯度不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，從而大大提高了分辨率。但是，2－DE依然存在缺陷：①分離蛋白質(zhì)數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于人類(lèi)基因組數(shù)所表達(dá)蛋白質(zhì)。②不易分離分子量大于200KD或小于10KD的蛋白質(zhì)。③不易分離疏水蛋白、膜蛋白、低豐度蛋白。④不易分離極酸或極堿蛋白。所以 “2－DE是否已過(guò)時(shí)？”也反復(fù)的被提出。迄今，許多人努力尋找替代2－DE的方法，促進(jìn)了其他的蛋白質(zhì)分離、分析技術(shù)的出現(xiàn)。例如：“液相色譜技術(shù)”在一定程度上克服了2－DE的缺陷，與2－DE比較，液相色譜技術(shù)在對(duì)分離疏水蛋白及膜蛋白等方面上具備獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［12］。然而這種技術(shù)卻不足以替代具有高分辨能力的、成熟技術(shù)路線(xiàn)的2－DE。

總的來(lái)講，鑒于蛋白質(zhì)的豐度和性質(zhì)的多樣性，不可能僅用一種分離技術(shù)就能應(yīng)對(duì)所有的蛋白質(zhì)組分析的需求。因此，多項(xiàng)技術(shù)互補(bǔ)性應(yīng)用在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中不可忽視。

2.3 質(zhì)譜技術(shù)

1912年，英國(guó)物理學(xué)家Joseph John Thomson研制出第一臺(tái)質(zhì)譜儀。但直到20世紀(jì)40年代，質(zhì)譜技術(shù)才廣泛應(yīng)用于有機(jī)物質(zhì)的分析。20世紀(jì)80年代“四大軟電技術(shù)”的出現(xiàn)，讓質(zhì)譜技術(shù)從此邁入生物質(zhì)譜時(shí)代。常用的質(zhì)譜技術(shù)主要有：①電噴霧質(zhì)譜技術(shù)（ESI－MS）［13］：基本原理是毛細(xì)管出口處所產(chǎn)生的高壓把毛細(xì)管流出的液體霧化成帶電荷的小液滴。隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面電荷強(qiáng)度越來(lái)越大，最終液滴變成帶有大量一個(gè)或者多個(gè)電荷的離子，致使分析物質(zhì)以電荷形式進(jìn)入氣相。其特點(diǎn)為，通過(guò)產(chǎn)生的高電荷離子，使質(zhì)量／電荷降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器可以檢測(cè)的范圍，所以ESI－MS大大提高了分析范圍。②基質(zhì)輔助激光解吸吸附質(zhì)譜技術(shù)（MALDIMS）［14］：基本原理是將分析的物質(zhì)分散在基質(zhì)分子中并形成晶體。當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射吸收大量的能量，基質(zhì)分子因能量蓄積而迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進(jìn)入氣相。MALDI常與TOF聯(lián)合使用，而TOF可檢測(cè)的分子質(zhì)量沒(méi)有上限，因此，MALDI－TOFMS適合對(duì)核酸、多肽、蛋白質(zhì)及多糖的檢測(cè)。③表面增強(qiáng)激光解析離子化／飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（SELDITOF－MS）：該技術(shù)是由 MALDI－TOF發(fā)展而來(lái)的，是一項(xiàng)蛋白芯片技術(shù)。其基本原理是待測(cè)樣品與有廣泛結(jié)合特性的芯片結(jié)合，然后直接進(jìn)入MALDITOF的檢測(cè)。它的開(kāi)展解決了以往蛋白質(zhì)研究中費(fèi)力、耗時(shí)、不適合臨床大規(guī)模篩查的弊端。

目前質(zhì)譜技術(shù)已成為測(cè)定生物大分子（蛋白質(zhì)、多肽、多糖等）的有效工具，也是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)之一［15］。

3 肺癌與肺結(jié)核的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，肺癌與肺結(jié)核的診斷及鑒別診斷無(wú)論從方法多樣性或檢出率上都有了很大的改觀(guān)。但至今仍未找到一種快速、特異、廉價(jià)、高效的方法去鑒別兩種疾病。目前只能靠多種檢查來(lái)綜合判定，最可靠的方法是病理組織活檢及細(xì)菌學(xué)檢查。然而病理組織活檢創(chuàng)傷較大、細(xì)菌學(xué)檢查時(shí)間長(zhǎng)，檢出率低等，都直接制約了兩種疾病的鑒別效果，同時(shí)也阻礙了臨床早期治療。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)及發(fā)展，為兩種疾病的研究提供了新的平臺(tái)。從蛋白質(zhì)水平揭示兩種疾病的相關(guān)性及差異性，為兩者的鑒別診斷研究奠定了基礎(chǔ)。

3.1 蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型的鑒別診斷價(jià)值

蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型是最佳的蛋白峰組合，其檢測(cè)靈敏度、特異度都要高于單一蛋白質(zhì)診斷效率，具有一定的診斷及鑒別診斷價(jià)值，對(duì)肺癌及肺結(jié)核的診斷及鑒別診斷有著潛在的研究?jī)r(jià)值。王琳等［16］收集肺結(jié)核、肺癌患者及正常人的血清標(biāo)本各65例，采用WCX2芯片技術(shù)對(duì)血清蛋白進(jìn)行捕獲，用蛋白芯片閱讀器PBSⅡ?qū)π酒M(jìn)行分析比較，65例活動(dòng)性肺結(jié)核與65例肺癌患者的血清蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯 示：4 個(gè) 蛋 白 峰 （5335m／z、8048m／z、11700m／z、11683m／z）傾向于肺結(jié)核（P＜0.01），該診斷模型判別的總準(zhǔn)確率為74.6% （97／130），靈敏度80.0%（52／65），特異度69.2% （45／65）。而Liu等［17］收集了87位結(jié)核病患者（51位涂片陽(yáng)性、36位涂片陰性）、68位非結(jié)核病患者（55位健康人、13位其他呼吸系統(tǒng)疾?。肧ELDI－TOF－MS分離血清蛋白質(zhì)，并得到血清蛋白質(zhì)的指紋圖譜，最終選定9個(gè)質(zhì)譜峰建立診斷模型，并對(duì)測(cè)試組檢測(cè)，診斷準(zhǔn)確率為80%；聚類(lèi)分析顯示：m／z 4821.45，4792.74分辨涂片陰性結(jié)核患者和對(duì)照組的準(zhǔn)確度為81.59%。

3.2 標(biāo)志物的鑒別診斷價(jià)值

標(biāo)志物的檢測(cè)具有快速、高效、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，可提高臨床診斷的效率，也是鑒別診斷的理想指標(biāo)。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找疾病特異的標(biāo)志物，可為研究疾病的早期診斷及兩種疾病的鑒別診斷提供新的思路。

Liu等［18］對(duì)227例血清樣品（146例肺癌、13例肺炎、28例結(jié)核性胸膜炎和40例正常人血清樣品）進(jìn)行蛋白質(zhì)譜檢測(cè)，鑒定出3個(gè)能把肺癌組與肺炎組、結(jié)核性胸膜炎組、正常人組區(qū)分開(kāi)來(lái)得差異蛋白。質(zhì)譜鑒定這3個(gè)差異蛋白峰分別為“野生型甲狀腺運(yùn)載蛋白”以及它的兩個(gè)變體。Chen［19］運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)“非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCL－H266”和“腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系 H226BR”的分泌蛋白對(duì)比研究中，發(fā)現(xiàn)了LDHB在非小細(xì)胞肺癌患者血清中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于結(jié)核患者、肺炎患者和正常人的血清中的表達(dá)水平。林全［20］通過(guò)2－DE、MALDI－TOF－MS對(duì)癌性胸腔積液及結(jié)核性胸腔積液的差異蛋白進(jìn)行了比較研究，其中有9個(gè)點(diǎn)僅在結(jié)核性胸腔積液表達(dá)，11個(gè)點(diǎn)僅在肺癌胸腔積液中表達(dá)，最終選取差異顯著的10個(gè)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，成功鑒定了6個(gè)蛋白質(zhì)。Rodriguez－Pineiro等［21］利用2－DE和質(zhì)譜技術(shù)分別從“非小細(xì)胞肺癌和肺炎病人的血清水平”、“非小細(xì)胞肺癌和肺結(jié)核病人的胸腔積液水平”進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)PEDF在非小細(xì)胞肺癌患者的血清和胸腔積液中的表達(dá)高于結(jié)核患者與肺炎患者組；而凝溶膠蛋白和金屬蛋白酶抑制劑2在非小細(xì)胞肺癌的胸腔積液中表達(dá)高于結(jié)核患者胸腔積液、S100－A8和S100－A9在非小細(xì)胞肺癌的胸腔積液中處于低表達(dá)。He等［22］應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了一種新的非小細(xì)胞肺癌的腫瘤抗原α－烯醇酶，并聯(lián)合ELISA方法檢測(cè)α－烯醇酶的自身抗體，發(fā)現(xiàn)α－烯醇酶在非小細(xì)胞肺癌組中自身抗體陽(yáng)性率較高，為27.65%。而其他肺部疾?。òńY(jié)核病）僅在正常對(duì)照組發(fā)現(xiàn)了1例。

4 展望

在同一疾病不同發(fā)展階段或不同疾病，其蛋白質(zhì)表達(dá)往往存在差異，這些差異蛋白可能與該疾病的發(fā)生和發(fā)展有直接或間接的關(guān)系［23］，也可根據(jù)這些差異蛋白對(duì)疾病進(jìn)行診斷及鑒別診斷［24］。目前，在蛋白組學(xué)水平上對(duì)兩種疾病的鑒別診斷研究還較少。但是，不論那種疾病的特異性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)都將會(huì)對(duì)兩種疾病的診斷及鑒別診斷做出巨大貢獻(xiàn)。如今蛋白質(zhì)組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于各種疾病及同一疾病不同層面的研究。未來(lái)對(duì)肺癌及肺結(jié)核的鑒別診斷研究將會(huì)成為新的研究方向，也必將為兩種疾病的診斷和個(gè)體化治療提供新型技術(shù)手段。

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