俞丕超，張建偉

(1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心，山東 濟南 250011)

在婦科領(lǐng)域中，各種疾病發(fā)病機制及各種新的治療方法的研究在很大程度上依賴于動物實驗研究。隨著婦科疾病的發(fā)生、發(fā)展，病證結(jié)合動物模型成為重要的實驗方法和手段。目前婦科病證結(jié)合動物模型的研究主要涉及月經(jīng)病、婦科雜病等，將病和證緊密的結(jié)合，更好地模擬臨床狀態(tài)。

1 婦科病證結(jié)合模型的造模方法

1.1 復(fù)合因素建立婦科病證結(jié)合模型 該方法是指在中醫(yī)藥理論的指導下，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學理論與實驗動物科學知識，分別(或同時)采用傳統(tǒng)中醫(yī)學病因復(fù)制證候動物模型和現(xiàn)代醫(yī)學病因復(fù)制疾病模型，使模型動物同時具有疾病和證候特征。

1.1.1 肝郁血瘀型宮環(huán)出血病證結(jié)合大鼠模型 李慧[1]選用體質(zhì)量(280±300)g SD雌性大白鼠，已育未孕，采用秦大蓮等[2]的造模方法略加改進，通過手術(shù)將改造后的IUD固定于右側(cè)子宮壁上，手術(shù)7 d后，參照高蕭楓等[3]的方法結(jié)合孤養(yǎng)造成肝郁模型，將大鼠單籠孤養(yǎng)，用細紗條束縛四肢，使其正常生存本能受阻而不能表達，導致肝疏泄不及，形成一種“郁怒”狀態(tài)，持續(xù)時間從第1天的4 h逐漸增至每天6 h，連續(xù)28 d。自造模第22天開始予宮環(huán)止血Ⅰ號(香附10 g，白芍10 g，三七3 g，炒蒲黃10 g，馬鞭草12 g，仙鶴草10 g，女貞子10 g，旱蓮草10 g。經(jīng)80 ℃水浴蒸發(fā)濃縮成含生藥1.5 g/mL的濃縮藥液，置4 ℃冷藏備用)按0.665 g/100(g·d)灌胃，共計7 d。以大鼠的體質(zhì)量、蔗糖水攝入量以及行為學指標的變化作為觀察指標，并應(yīng)用抗體芯片技術(shù)測量動物模型子宮組織細胞因子水平。造模成功后大鼠表現(xiàn)出飲食、活動減少，喜歡貼壁、叫聲尖細、胡須下垂、反應(yīng)遲緩等情志和行為的改變，符合肝郁證動物模型的癥狀[4-5]。體質(zhì)量增長緩慢，蔗糖攝入率降低，提示肝郁大鼠模型快感缺乏，對獎賞刺激興趣缺失，藥物治療后以上癥狀均得到緩解。子宮組織細胞因子中睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)顯著降低，白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)顯著升高，而治療藥物可逆轉(zhuǎn)這種表達，甚至使其接近正常水平。

1.1.2 氣虛血瘀證卵巢癌大鼠模型 張勤華等[6]選用清潔級Wistar雌性大鼠，體質(zhì)量100～120 g，4～6周齡。手術(shù)將致癌劑二甲基苯蒽(DMBA)藥線埋入大鼠卵巢內(nèi)，術(shù)后將大鼠放回籠中飼養(yǎng)[7]。正常飲食+大黃芒硝合劑(大黃煎煮去渣，與芒硝按照4：1的比例濃縮成含生藥1.5 g/mL的藥液備用，藥量按成人每kg體質(zhì)量的20倍計量)灌胃2 mL/隔日×4周，共8周。觀察大鼠的毛發(fā)、飲食、排泄、活動等情況。每周測量大鼠體質(zhì)量，繪制體質(zhì)量增長曲線。造模成功后大鼠體質(zhì)量增長緩慢、腫瘤出現(xiàn)提前、腹水發(fā)生增加。35周全部處死剖腹探查。比較平均成瘤時間，腫瘤發(fā)生率、轉(zhuǎn)移及腹水發(fā)生率，35周之前死亡的當即剖腹探查。在灌胃2、4、8周分別取大鼠尾靜脈血，制成涂片，用圖像分析儀測出30個T淋巴細胞核仁銀染強度的平均值，用核仁銀染面積(S核仁)與細胞核面積(S核)的比值來表示。同時取0.5 mL血，按照郭峰[8]紅細胞免疫黏附酵母菌花環(huán)法，以紅細胞結(jié)上1個或以上酵母菌算1個花環(huán)，計數(shù)100個紅細胞的花環(huán)率。崔英等[9]證實，卵巢癌患者出現(xiàn)繼發(fā)性紅細胞免疫功能降低。造模后大鼠紅細胞C3b受體花環(huán)率顯著降低，從而驗證了模型的成功。

1.1.3 更年期綜合征陰虛內(nèi)熱證大鼠模型 胡隨瑜等[10]選用(162.4±2.3)gWistar雌性大鼠，手術(shù)摘除大鼠的卵巢，術(shù)后第4、5、6、7天逐只進行陰道涂片檢查，以確定卵巢摘除完全。術(shù)后第8天，開始灌服熱性中藥(制附片25 g和干姜25 g等量水煎煮成含生藥濃度為50%，按劑量20 mL/kg灌胃)，連續(xù)灌服14 d。停止造模后第10天，模型大鼠血清E2的水平下降，LH、FSH的水平上升，子宮重量減輕，并且出現(xiàn)血漿NE、E、腦組織5-HT值升高、體質(zhì)量增長緩慢、舌尖色紅、飲水量增加、肛溫上升等陰虛內(nèi)熱證[11]。在末次灌服熱性中藥24 h后，開始治療性給藥，灌服地貞顆粒9 d后,大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌的紊亂和陰虛內(nèi)熱的癥狀明顯改善，則造模成功。

1.1.4 腎虛血瘀型子宮內(nèi)膜異位癥模型 冉青珍等[12]選用體質(zhì)量200 g雌性SD大鼠，3月齡。每日進行陰道細胞涂片檢查，選擇動情周期[13]4～5 d者為合格動物。在腎虛血瘀證模型的基礎(chǔ)上按西醫(yī)“自體移植法”造子宮內(nèi)膜異位癥疾病模型[14]。造模成功后大鼠被毛蓬松、硬、凌亂，拱背少動、扎堆怕冷、大便稀溏等。舌質(zhì)絳紫黯淡；尾部自尖至根出現(xiàn)不同程度皮下瘀紫或青斑、眼球轉(zhuǎn)為黯紅；后肢行動艱難遲緩等腎虛與血瘀的臨床表現(xiàn)。血液流變學各項指標明顯升高，即血液呈“黏滯”狀態(tài)，符合中醫(yī)“血瘀”微觀狀態(tài)。

1.2 單一因素建立婦科病證結(jié)合模型 該方法是指使用單一因素作為病證結(jié)合模型疾病與證候共同的造模因素。

1.2.1 經(jīng)前期綜合征肝氣郁證大鼠模型 宋洪運[15]選用健康SD雌性大鼠,體質(zhì)量180～220 g。按陰道涂片鏡檢法觀察大鼠各期細胞形態(tài)及數(shù)量，確定動情周期，選取處于動情后期的大鼠納入實驗。參照文獻[16]方法束縛造模，將擬造模大鼠前足與對側(cè)后足用無菌紗布捆縛，妨礙其自由活動，同時造?；\中放入自由活動大鼠以增強致郁效應(yīng)。造模同時每日給經(jīng)前舒顆粒(10 g/kg，相當于人臨床8倍劑量)，造模完成后即進行曠場實驗測定相關(guān)行為學指標[17]，隨后處死。斷頭取血，以放射免疫法測定血清E2、FSH、LH含量。造模后曠場實驗得分顯著減少，提示大鼠活動量明顯減少，興奮性降低，大鼠行為表情結(jié)果則不活躍，精神萎靡，眼神呆滯，相互扎堆睡覺，對外界刺激不敏感。E2水平下降，F(xiàn)SH水平顯著上升，LH無明顯變化，F(xiàn)/L比增大，提示大鼠存在卵巢功能衰退的生理變化。而給予經(jīng)前舒顆粒干預(yù)后，肝郁癥狀緩解，相關(guān)指標得到恢復(fù)或改善。

1.2.2 腎陽虛排卵障礙大鼠模型 時思光[18]選用體質(zhì)量(220±10)g SD雌性大白鼠，未孕未產(chǎn)，10～12周齡，每日下肢肌注氫化可的松注射液36 mg/kg，連續(xù)11 d。給藥第5天起，造模大鼠逐漸出現(xiàn)一系列“腎陽虛”的表現(xiàn),給藥11 d后將造模大鼠開腹，腹主靜脈取血，測定血清E2、FSH、LH水平均明顯降低，取子宮、卵巢，顯微光鏡下組織形態(tài)學及超顯微結(jié)構(gòu)檢查，病理改變提示為排卵抑制，造模后大鼠陰道涂片周期性變化消失，符合腎虛排卵障礙的證候與病理特征，則造模成功。

1.2.3 腎虛黃體抑制流產(chǎn)病證結(jié)合動物模型 寧艷等[19]選用健康、未產(chǎn)、10～12周齡、體質(zhì)量約200～250 g的SD大鼠，參照周莉等[20-21]的報道，采用羥基脲和米非司酮造模。按雌、雄為2∶1合籠，置于18～24 ℃動物房中喂養(yǎng)。每日晨陰道涂片，以發(fā)現(xiàn)大量精子日作為妊娠第1天。從妊娠第1天到第10天灌服羥基脲(450 mg/kg)造成黃體抑制模型，第11天灌服米非司酮(3.75 mg/kg)，第12天將大鼠麻醉后解剖，剪取子宮稱重，記錄胚胎數(shù)和流產(chǎn)數(shù)，0、10、11、12 d 均取血液樣本，-20℃保存血清，測定自由基過氧化物歧化酶(SOD)，觀察妊娠大鼠子宮內(nèi)胚胎發(fā)育和流產(chǎn)情況。妊娠大鼠均于造模后幾天出現(xiàn)納食減少、活動減少、反應(yīng)遲鈍、毛色干枯等癥狀，體質(zhì)量明顯下降，SOD明顯降低[22]。研究[23]提示自由基含量可作為腎虛證的辨證指標之一。造模后胚胎著床數(shù)減少。

2 問題與展望

綜合近年來婦科病證結(jié)合動物模型的研究，存在以下問題：1)目前主要局限于月經(jīng)病的研究，辨證分型尚缺少系統(tǒng)研究，局限于肝郁、腎虛。2)模型制備上，多為疾病動物模型與中醫(yī)證候動物模型嫁接，需創(chuàng)建符合婦科疾病特點的病證結(jié)合動物模型并使之規(guī)范化。3)以證候為內(nèi)容的模型評價體系尚不健全，血瘀、氣滯、濕熱、脾虛、陰虛等這些辨證類型的標準尚無統(tǒng)一定論。今后的研究方向：1)中醫(yī)婦科學在臨床應(yīng)用中的突出特色與優(yōu)勢在于調(diào)經(jīng)、助孕、安胎、治療帶下病、產(chǎn)后病及雜病等。因此除月經(jīng)病應(yīng)開展更多其他婦科疾病的病證結(jié)合研究，如妊娠病、產(chǎn)時病、產(chǎn)后病、婦科雜病、前陰病等。從而為臨床工作奠定基礎(chǔ)。2)婦女“以血為本，以氣為用”。月經(jīng)、胎孕、產(chǎn)育、哺乳都是以血為用，血為氣之配，血病則氣不能獨化，氣病則血行不暢。故模型制備方法上，應(yīng)結(jié)合婦科的生理病理特點，在西醫(yī)疾病模型的基礎(chǔ)上，不施加人為干預(yù)因素，在疾病模型建立過程中或建成后，觀察并檢測疾病模型所表現(xiàn)的中醫(yī)證型(如陰陽、虛實、寒熱等)，從而更好地體現(xiàn)婦科疾病中醫(yī)“證”的階段性、動態(tài)性。3)對證候的評價標準除模型動物的宏觀體征、行為表現(xiàn)及與證候相關(guān)的個別理化指標，應(yīng)增加以方測證的評價標準，選用治療婦科疾病的古方、效方對所建立的模型進行證實，以方證相應(yīng)、方證相佐理論驗證所建立模型的可靠性。隨著中醫(yī)學研究的不斷深入及多學科的參與，相信婦科病證結(jié)合動物模型將會得到進一步提高和發(fā)展，從而更好地指導臨床。

[1]李慧.肝郁血瘀型宮環(huán)出血病病證結(jié)合大鼠模型的建立及研究[D].長沙:湖南中醫(yī)藥大學,2010:1-6.

[2]秦大蓮,陳美娟,李曉冰,等.固環(huán)止血膠囊對置IUD大鼠血漿及子宮組織ET和TXBZ的影響[J].中藥藥理與臨床,2006,22(3):149-150.

[3]高蕭楓,秦雪梅,王明軍.逍遙散和柴胡對慢性束縛應(yīng)激肝郁模型大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].中藥藥理與臨床,2005,21(2):6-7.

[4]徐舒,陳合兵,李洪,等.“肝郁證”大鼠模型的建立及代謝組學的初步研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2009,24(6):787-791.

[5]丁杰,陳家旭,李植延.肝氣郁結(jié)大鼠胃彩膜結(jié)構(gòu)和功能變化的實驗研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2007,34(2):229-232.

[6]張勤華,黃宗瀚,齊聰.原發(fā)性卵巢癌大鼠氣虛血瘀證模型的建立與研究[J].中國中醫(yī)藥雜志,2005,3(3):607-608.

[7]張勤華.增免抑瘤合劑合并化療對卵巢癌大鼠細胞免疫功能的影響[J].中國中醫(yī)藥雜志,2004,(5):501-502.

[8]郭峰.紅細胞免疫及其調(diào)節(jié)功能的測定[J].免疫學雜志,1990,6(1):60.

[9]崔英,郭峰,張其,等.卵巢腫瘤患者紅細胞免疫功能及超氧化酶的初步研究[J].第二軍醫(yī)大學學報,1995,16(6):558-560.

[10]胡隨瑜,尤勁松,向群輝,等.地貞顆粒對“更年期”擬陰虛內(nèi)熱證模型大鼠的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2000,11(3):143-145.

[11]劉家駿,劉健鴻,劉小勤,等.真氣意念調(diào)息對人體的生化—內(nèi)分泌指標的影響[J].中醫(yī)藥學刊,2002,20(5):622-623.

[12]冉青珍,陳萬群.腎虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥不孕癥動物模型的建立與評價[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2008,10(1):130-132.

[13]施新猷.醫(yī)學動物實驗方法學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1983:141-143.

[14]冉青珍,符路娣,陳萬群,等.子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血漿神經(jīng)內(nèi)啡肽特點及其對妊娠功能的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學學報,2006,23(3):222.

[15]宋洪運.經(jīng)前期綜合征肝氣郁證大鼠模型血清遞質(zhì)、激素和代謝組學研究[D].濟南:山東中醫(yī)藥大學,2010:3-8.

[16]喬明琦,張惠云,陳雨振,等.肝郁證動物模型研究的理論思考[J].中國醫(yī)藥學報,1997,12(5):42.

[17]劉曉偉,張紅梅,曲宏達,等.“怒傷氣”大鼠行為觀察與檢測[J].江蘇中醫(yī)藥,2005,26(3):53.

[18]時思光.補腎寧對腎陽虛排卵障礙大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及生殖機能調(diào)控的實驗研究[D].哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學,2010:44-49.

[19]寧艷,羅頌平,梁國珍.補腎健脾中藥復(fù)方對腎虛黃體抑制妊娠大鼠流產(chǎn)模型的實驗研究[J].中國醫(yī)學學報,2000,15(6):28-30.

[20]周莉,吳純啟,姜忠彩,等.羥基脲對大鼠生育能力的影響[J].毒理學雜志,2006,20(3):167-168.

[21]崔美蘭,黃雅文,黃桂華.藥物流產(chǎn)中米非司酮最適劑量探討[J].國際醫(yī)藥衛(wèi)生導報,2007,13(14):81-83.

[22]陳晏珍.腎虛與超氧化物歧化酶關(guān)系初探[J].中醫(yī)雜志,1989(4):34.

[23]韓勃.自由基與中醫(yī)證型研究概況[J].甘肅中醫(yī),1994,7(5):46.