段玉金

(晉中市榆次區(qū)第一人民醫(yī)院，山西晉中 030600)

骨缺損一直是困擾矯形外科醫(yī)師的一大難題，相關(guān)研究雖然較多，但目前仍沒有一種令人滿意的治療方案。自體骨移植、同種異體骨、異體骨、異質(zhì)成形骨替代移植在臨床重建治療中均有應(yīng)用。自體骨是臨床最常用的移植物，但由于供骨量的限制，且患者常出現(xiàn)取骨處疼痛、感染等并發(fā)癥，因此，理想骨移植材料的尋求和研制一直是骨科生物材料科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要課題。本研究應(yīng)用自制的異種脫蛋白松質(zhì)骨(xenogeneic deproteinised cancellous bone，XDCB）用于新西蘭大白兔橈骨中段骨缺損修復(fù)，通過觀察大體標(biāo)本、X線攝片、HE染色評價(jià)骨缺損的修復(fù)效果，以明確XDCB作為骨移植載體材料的可行性，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 移植材料制備 取新鮮成年豬(市售）股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨部分，截取骨塊內(nèi)不含軟骨及皮質(zhì)骨成分，初制為14mm×3mm×5mm，參照文獻(xiàn)的方法[1-3]通過脫脂、脫鈣、脫蛋白、鈷60輻射消毒等物理、化學(xué)處理，制備成XDCB載體。

1.2 兔橈骨干節(jié)段性骨缺損模型的建立與修復(fù) 選用健康新西蘭兔16只(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供），雌雄不限，10w齡，體重2.0±0.2kg，橈骨長為72±3mm。所有動物均無手術(shù)區(qū)創(chuàng)傷、感染及雙前肢畸形，也無其它全身疾病，且為同一飼養(yǎng)員喂養(yǎng)。新西蘭兔雙前肢前外側(cè)直切口，暴露橈骨干，切除橈骨干中段14mm(含骨膜)，造成橈骨干節(jié)段性骨缺損模型。采用自身對照的方法，隨機(jī)選取一側(cè)橈骨為空白對照;另一側(cè)為實(shí)驗(yàn)側(cè)，植入XDCB(14mm×3mm×5mm)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般情況及大體解剖觀察:觀察術(shù)后動物的活動、進(jìn)食及傷口愈合情況。處死動物后沿原切口進(jìn)入，觀察局部骨痂形成、骨斷端愈合情況。

1.3.2 X線攝片:分別于術(shù)后第4w、8w、12w、16w處死實(shí)驗(yàn)動物(各時間點(diǎn)隨機(jī)選取4只新西蘭兔），處死前各組兔攝取雙前肢正位X線片(條件45kV，100mA，0.08s，焦距90cm），觀察成骨情況。

1.3.3 組織學(xué)觀察:處死實(shí)驗(yàn)動物后，各時間點(diǎn)新西蘭兔骨標(biāo)本取材，行大體觀察后，經(jīng)常規(guī)甲酸-甲酸鈉脫鈣、脫水、石蠟包埋，縱形切片，片厚5μm，HE染色，光鏡下觀察橈骨骨缺損的修復(fù)情況，觀察分析成骨效能。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及大體解剖觀察 除1只實(shí)驗(yàn)兔并發(fā)雙前肢骨折伴骨折端外露，經(jīng)積極救治無效死亡外，余15只實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后3d精神和進(jìn)食恢復(fù)正常，5d活動基本正常，術(shù)肢傷口無紅腫及分泌物，無切口感染、皮膚壞死等并發(fā)癥。

2.1.1 空白對照側(cè):各個時間點(diǎn)均無骨組織形成，間隙充填纖維結(jié)締組織，僅在兩端形成一定骨痂，至12w橈骨干斷端髓腔封閉硬化。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)側(cè):術(shù)后4w，XDCB兩端與骨斷端接觸面已有較好結(jié)合，植入物表面有少量白色透明軟骨樣組織生成，移植物形狀與植入前基本一致。術(shù)后8w，植入物表面為白色透明軟骨樣組織覆蓋，兩端有骨痂生長，與XDCB骨膜延續(xù)，表面粗糙不平;12、16w，XDCB被骨痂完全包埋，植入骨與宿主骨界限消失，硬/軟骨痂橋接橈骨缺損處，透明軟骨樣組織逐漸鈣化，兩端骨橋與宿主骨相連，但直徑較鄰近宿主骨主骨部分纖細(xì)，仍有部分支架材料顆粒。術(shù)后各時期，XDCB周圍皮膚軟組織未見變性、壞死等異物排異反應(yīng)表現(xiàn)。

2.2 X線攝片

2.2.1 空白對照側(cè):雖在8w可見宿主骨斷端有少量新骨形成，但12w、16w時X線片上均表現(xiàn)為骨端硬化、封閉、骨不連(圖1，見封二）。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)側(cè):術(shù)后4w時植入材料呈密度較高表現(xiàn)，與宿主骨之間間隙明顯;8w時材料與宿主骨間模糊，可見少許骨痂生長;12w連續(xù)觀察，可見XDCB表面及兩側(cè)逐漸模糊，橈骨缺損兩斷端間逐漸出現(xiàn)密度增高骨痂，XDCB體積漸縮小，密度漸接近于宿主骨;16w時，斷端接合部分骨痂密度、數(shù)量明顯增加，有部分出現(xiàn)連續(xù)性骨痂，但密度仍略小于宿主骨(圖2，見封二）。

2.3 組織學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)側(cè):術(shù)后4w，植入骨兩端可見少量新生軟骨及少量不成熟的骨組織，呈島狀或條梭形，可見少許軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及骨細(xì)胞，有少許纖維結(jié)締組織長入植入物中，可見少許散在多核巨噬細(xì)胞。術(shù)后8w，出現(xiàn)較多新生軟骨及部分編織骨組織，有部分骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，可見較多的軟骨細(xì)胞、部分成骨細(xì)胞及膠原組織，巨噬細(xì)胞略減少。術(shù)后12w，植入骨兩端與宿主骨連接處出現(xiàn)較多的新生軟骨及部分成熟的骨組織，XDCB部分降解吸收縮小，新骨貼附植入材料生長(圖3，見封二)。術(shù)后16w，新生骨進(jìn)一步改建，大量新生的編織骨相互融合生長，部分可見兩側(cè)皮質(zhì)間連續(xù)骨痂貫穿缺損全長，中央仍可見富含細(xì)胞的新生骨，新骨逐步改建，部分形成板層骨結(jié)構(gòu)、骨小梁和髓腔結(jié)構(gòu)，XDCB大部分降解吸收，仍可見部分材料殘留，多核巨噬細(xì)胞仍存在(圖4，見封二)。

3 討論

骨組織工程支架材料可分為人工合成材料和天然生物衍生材料兩大類。人工合成材料包括羥基磷灰石(HA)、磷酸三鈣(TCP)、鈣磷陶(HA/TCP)、生物活性玻璃陶瓷(BGC)等生物陶瓷類和以聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)及二者的共聚物(PLGA)為代表的高分子有機(jī)合成材料。但上述材料需要特殊工藝制作，相對費(fèi)用較高，并且研究發(fā)現(xiàn)HA陶瓷骨引導(dǎo)作用較差、不降解，F(xiàn)elsenfeld研究發(fā)現(xiàn)，多孔陶瓷板植入骨創(chuàng)面2年，其孔內(nèi)僅17%為新骨組織，而44%仍為軟組織，說明其應(yīng)用也有一定的弊端。生物衍生骨來源包括異種骨和異體骨。異體骨的優(yōu)點(diǎn)是成分和結(jié)構(gòu)與受體相同，但異體骨同樣有排斥反應(yīng)，并有供體來源有限、傳播疾病及倫理問題等缺點(diǎn)。近年來，異種骨作為骨組織工程支架材料逐漸被認(rèn)識。由于異種骨具有自體骨相同的骨小梁結(jié)構(gòu)，不存在供體來源受限和醫(yī)學(xué)倫理問題等特點(diǎn)，通過脫脂脫蛋白等物理、化學(xué)方法制作異種脫蛋白松質(zhì)骨(XDCB），具有人工合成材料難以相比的天然網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)系統(tǒng)以及骨鹽成分，保留有原骨的骨小梁、小梁間隙及骨內(nèi)管腔系統(tǒng)[4-5]。因此，本研究選用新鮮豬股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨部分，截取一定大小，參照高春陽[1]、陳文斌[3]、牛云[2]等人的方法，自行制作該載體，由于制作要求較低，難度不大、費(fèi)用較低，且具有一定的強(qiáng)度，將其作為骨組織工程支架材料載體有一定的應(yīng)用前景。

已有學(xué)者[6]將XDCB作為載體進(jìn)行相應(yīng)的測試研究，證實(shí)該材料無機(jī)成分為羥基磷灰石，有機(jī)成分為Ⅰ型膠原，力學(xué)性能良好，免疫原性檢測陰性，無細(xì)胞毒性。本研究將XDCB植入兔橈骨中段14mm骨缺損處，觀察16w。其中1只兔并發(fā)雙前肢骨折，考慮術(shù)中造缺損時，骨刀截取力度過大，骨刀撞擊尺骨，引起尺骨損傷所致。另外15只實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后活動和進(jìn)食正常，未見植入物周圍組織液化、壞死，切口均為一期愈合，無紅、腫、熱等感染并發(fā)癥表現(xiàn)。連續(xù)行XDCB脫鈣組織切片發(fā)現(xiàn)，4w時可見植入骨與宿主骨之間少許巨噬細(xì)胞存在，而8-16w連續(xù)觀察時巨噬細(xì)胞略減少，但仍存在，未見淋巴細(xì)胞，考慮為機(jī)體正常免疫反應(yīng)所致;且植入材料隨觀察時間延長，逐步降解吸收，可見周圍組織長入其中，與宿主骨及周圍組織之間相互融合，以上均說明XDCB有良好的生物相容性。

本研究發(fā)現(xiàn)，XDCB在4w時邊緣部分開始降解，大體標(biāo)本觀察表面粗糙不平;組織切片觀察，植入XDCB材料邊緣可見破骨細(xì)胞，并在與宿主骨交界處降解部位有部分軟骨組織形成，繼而發(fā)生軟骨內(nèi)成骨，中心部位為未降解的脫蛋白松質(zhì)骨無定型組織，有部分纖維連接長入。隨觀察時間的延長，降解區(qū)由材料邊緣向中心進(jìn)展，降解區(qū)無體積缺失、縮小，未形成空腔，降解材料被新生軟骨或骨組織包圍。各個階段組織切片均可見多核巨噬細(xì)胞，考慮XDCB降解主要是由多核巨噬細(xì)胞吞噬吸收完成[7];Lassus等[8]也認(rèn)為多核巨噬細(xì)胞有骨吸收作用。因此，本研究中XDCB植入體內(nèi)后，多核巨噬細(xì)胞浸潤對植入材料的降解吸收發(fā)揮了作用，同時出現(xiàn)新骨漸貼附材料生長，進(jìn)而完成骨缺損的修復(fù)[7]。植入骨與宿主骨交界部分新生組織4w脫鈣組織切片發(fā)現(xiàn)，宿主骨床的內(nèi)外骨膜、骨髓、毛細(xì)血管等組織向植入XDCB的降解區(qū)長入，可見骨前體細(xì)胞(成軟骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞）先轉(zhuǎn)化為軟骨或類骨組織，后再轉(zhuǎn)化為骨組織，新生骨與植入材料直接接觸，彼此間無纖維組織填充。隨觀察時間的延長，植入材料逐漸降解吸收縮小，周圍被新骨包圍，并漸形成成熟板層骨和髓腔結(jié)構(gòu)，考慮可能是XDCB中的羥基磷灰石降解后釋放的鈣離子，促使宿主骨膜形成軟骨或類骨組織鈣化而形成新骨包圍植入骨[9]。但16w時XDCB中心仍有部分未降解，說明XDCB作為組織工程載體具有一定的生物降解性和骨傳導(dǎo)性，亦說明該材料植入骨缺損處后呈邊降解、邊成骨、邊改建過程，降解過程從植入骨周邊處開始。

本研究參考文獻(xiàn)制作的XDCB人工骨，體外測試具有一定機(jī)械強(qiáng)度，空隙率達(dá)到60-70%左右，而有關(guān)該材料的免疫原性、細(xì)胞毒性、肌肉包埋等實(shí)驗(yàn)已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，證實(shí)該材料組織相容性好，無細(xì)胞毒性[2，10]。本研究將該材料單獨(dú)植入兔橈骨骨缺損處，發(fā)現(xiàn)其不但具有良好的生物相容性，而且具有較好的骨傳導(dǎo)性，應(yīng)進(jìn)一步完善XDCB材料對骨缺損修復(fù)過程的研究，也為將其作為臨床應(yīng)用修復(fù)骨缺損提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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