王振宇，王希文，孫忠人，劉睿姝

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)針灸臨床神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040)

腦缺血再灌注損傷后缺血周邊半暗帶區(qū)的神經(jīng)元死亡與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)腦卒中細(xì)胞凋亡的調(diào)控起著重要作用［1～2］。目前研究已證實(shí)腦缺血預(yù)處理可以抑制腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)室既往研究表明針灸預(yù)處理具有顯著的抗腦缺血后細(xì)胞凋亡、減輕神經(jīng)功能缺損的作用［3～6］。本課題以局灶性腦缺血再灌注大鼠模型為觀察對(duì)象，研究電針預(yù)處理對(duì)JAK/STAT家族中的重要成員STAT3蛋白表達(dá)的影響，以期從一個(gè)側(cè)面再次證明針灸預(yù)處理是抑制腦缺血后細(xì)胞凋亡的有效手段。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

健康Wistar大鼠36只，雄性，體質(zhì)量180～200 g，1．5月齡。購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號(hào):P00102004。pSTAT3單克隆抗體均為Santa Cruz，CA公司產(chǎn)品;Western blotting試劑盒為美國Upstate Biotechnology，Inc公司產(chǎn)品;TTC試劑盒為上海國藥集團(tuán)產(chǎn)品。

1．2 造模方法

采用改良的Longa法制備局灶性腦缺血再灌注損傷(MCAO)大鼠模型:10%的水合氯醛注射液(300 mg/kg)腹腔麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，左旁正中縱行切開頸部皮膚約25 mm，仰臥位暴露并且鈍性地游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎同側(cè)頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈;距離頸總動(dòng)脈的分叉處約2～3 mm處刺一小口入栓塞線，松開頸內(nèi)動(dòng)脈動(dòng)脈夾，栓線經(jīng)頸總動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，達(dá)到大腦前動(dòng)脈起始部位，遇到阻力后停止，長度約為20～22 mm，然后用縫合線系住栓塞線，最后確認(rèn)無出血后再縫合皮膚，缺血90 min后將栓塞線拔出約10 mm形成缺血再灌注。假手術(shù)組大鼠不插入栓塞線，其他步驟同手術(shù)組。

1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組:假手術(shù)組(sham)、模型組(MCAO)、電針預(yù)處理組(EA)，每組12只動(dòng)物，分別于手術(shù)后24 h斷頭取腦，每組6只用于TTC染色，6只Western blotting。

1．4 電針預(yù)處理方法

電針預(yù)處理于造模前7天(實(shí)驗(yàn)第1天)，每日早8∶00開始給予電針治療，每日1次，至實(shí)驗(yàn)造模(實(shí)驗(yàn)第7天)。將大鼠置于固定器內(nèi)，待大鼠安靜20 min后，將0．25 mm×13 mm毫針?biāo)酱倘氪笫箢^皮左、右“神聰穴”與左、右“懸厘穴”約5 mm，采用KWD－808Ⅱ型脈沖電針儀，分別連接兩側(cè)“神聰穴與懸厘穴”，規(guī)律脈沖電波，強(qiáng)度6 V，頻率分別2/100 Hz(2 Hz和100 Hz交替)持續(xù)30 min。

1．5 腦梗死體積的觀察

大鼠在缺血再灌注24 h后迅速斷頭取腦，取出腦組織后將其放置在－20℃冰箱中快速冷凍15 min，均勻的由前向后于冠狀位切成厚度2 mm的腦組織6片，把切好的腦片立即避光放置在2%TTC磷酸緩沖溶液當(dāng)中，37℃下恒溫孵育0．5～1 h，待腦片完全地顯示顏色后放置在4%多聚甲醛溶液中固定。血供正常組織染色呈紅色，缺血組織顏色無變化，呈白色。病理圖象分析系統(tǒng)測(cè)量腦梗死體積。

1．6 Western blotting

Western blotting檢測(cè)按照常規(guī)方法進(jìn)行。大鼠在缺血再灌注24 h后，10%的水合氯醛注射液(300 mg/kg)腹腔麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，立即斷頭取腦，于冰上分離缺血側(cè)腦組織的頂葉皮層，立即用冰生理鹽水沖洗，然后放置在液氮罐中低溫下保存。從液氮罐中取出腦組織，放置在組織勻漿器中，按照1∶5(w/v)加入細(xì)胞裂解液，立即放置在冰上勻漿。等待裂解30 min后迅速用移液器將裂解液移到1．5 ml的離心管當(dāng)中，采用12 000 r/min 4℃下離心操作10 min，取離心的上清液置于－80℃保存。用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定法檢測(cè)蛋白總量。加樣量為每孔20μg蛋白。于所制備的樣本中加入上樣緩沖液，迅速混勻后煮5 min，10 000 r/min下離心操作10 min，在SDS－PAGE電泳上等量上樣，在電泳操作完畢之后，迅速把蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后采用PBS液進(jìn)行封閉，再加入P－STAT3鼠單多克隆抗體(1∶1 200)及抗 β －actin(1∶2 000)抗體，將第一抗體稀釋放置于含3%脫脂奶粉的PBS緩沖液中，4℃下反應(yīng)過夜后將膜取出，然后用PBS緩沖液洗滌3次，加入山羊抗兔/兔抗小鼠IgG二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記)進(jìn)行孵育，最后采用化學(xué)發(fā)光法，X－光片下記錄檢測(cè)結(jié)果。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 電針預(yù)處理對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦梗死體積的影響

局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的左側(cè)大腦中動(dòng)脈梗死區(qū)域主要位于缺血側(cè)的額頂背外側(cè)皮層。電針預(yù)處理治療后腦梗死體積及腦組織腫脹程度與模型組比較均顯著性降低(P＜0．05)，局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的梗死體積縮小部位主要存在于梗死灶的周邊，見圖1。

2．2 電針預(yù)處理對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織pSTAT3蛋白表達(dá)的影響

假手術(shù)組不存在pSTAT3蛋白的表達(dá)，局灶性腦缺血再灌注損傷24 h后pSTAT3蛋白表達(dá)顯著性增加，電針預(yù)處理能部分抑制pSTAT3蛋白表達(dá)，與模型組相比有顯著性差異(P＜0．05)，見圖2。

3 討論

在局灶性腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的發(fā)生為高度精密調(diào)節(jié)過程，涉及多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)腦卒中細(xì)胞凋亡的調(diào)控起著重要作用。STAT3是JAK/STAT家族中的重要成員，過量活化的STAT3對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，它能降低腦缺血再灌注損傷中重要的抗凋亡基因Bcl－2等的表達(dá)［7～8］。

圖1 A．缺血再灌注24 h后大鼠腦組織TTC染色;B．電針預(yù)處理治療后腦梗死體積與MCAO組比較顯著性降低

圖2 Western Blot結(jié)果顯示電針預(yù)處理能明顯抑制pSTAT3蛋白表達(dá)

針灸預(yù)防中風(fēng)(腦卒中)古來有之，唐代孫思邈的《備急千金要方》中有“惟風(fēng)宜防爾，針耳前動(dòng)脈及風(fēng)府神良”或“依腧穴灸之”的針灸預(yù)防中風(fēng)的具體記載。既往本實(shí)驗(yàn)室研究表明［3～6］，針灸預(yù)處理能夠減少腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，上調(diào)海馬CA1區(qū)Bcl－2、c－fos的基因和蛋白表達(dá)。本研究揭示電針預(yù)處理能顯著下調(diào)局灶性腦缺血再灌注腦組織pSTAT3蛋白含量，明顯降低腦梗死的體積，對(duì)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)有重要意義。

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