王娟 郭慶 邵麗春 武威 宋業(yè)朋 王孟巖 張軍 陳哲 周波 莊玲

失代償性肝硬化嚴(yán)重危害人類的健康，雖然肝移植是目前最有效的治療方法，但由于供肝的缺乏，手術(shù)技術(shù)的復(fù)雜和費(fèi)用的昂貴及術(shù)后的免疫排斥等因素限制了其開展的規(guī)模，細(xì)胞治療的研究為肝硬化的治療帶來新的治療前景。2010年12月至2011年8月，我們采用經(jīng)周圍靜脈移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)治療失代償期肝硬化21例，以觀察移植術(shù)后臨床癥狀和肝功能的改善及安全性，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年12月至2011年8月我科收治的失代償期乙型肝炎肝硬化患者21例，Child-Pugh分級(jí)C級(jí)，診斷符合2005年《病毒性肝炎防治方案》標(biāo)準(zhǔn)。其中男19例，女2例;年齡39～56歲，平均年齡(46±8)歲;平均病程(9±7)年。無感染、活動(dòng)性上消化道出血、嚴(yán)重肝昏迷、肝腎綜合征、肝癌患者。CT、核磁共振(MRI)或彩超影像學(xué)檢查均為重度肝硬化、脾大、門脈高壓患者，經(jīng)過內(nèi)科治療療效差。實(shí)驗(yàn)室檢查包括血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TB)、凝血酶原時(shí)間(PT)、白蛋白(ALB)、纖維蛋白原(FBG)、白細(xì)胞、血小板。同時(shí)給予綜合基礎(chǔ)治療。經(jīng)過醫(yī)院器官倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，在患者知情同意的情況下，簽定《知情同意書》。隨訪患者至HUCMSCs移植后第12周。

1.2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制備 UCMSCs懸液由深圳北科生物科技有限公司用靜脈內(nèi)膜酶消化法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、純化后提供，干細(xì)胞濃度(2 ～5)×107/ml，懸液量30 ml。

1.3 移植途徑及方法 患者取仰臥位，采用外周靜脈途經(jīng)使用輸血器輸注，取肘正中靜脈穿刺先用0.9%氯化鈉溶液建立靜脈通道，再連接復(fù)溫的細(xì)胞袋輸注UCMSCs懸液。滴入的時(shí)候注意控制滴速，30 ml懸液滴注10 min，再滴入0.9%氯化鈉

1.4 術(shù)后觀察 術(shù)后 2、4、8、12 周觀察 ALT、TB、PT、ALB、FBG、白細(xì)胞、血小板水平變化，觀察臨床癥狀(食欲、精神、體力、腹脹、腹水、下肢水腫)改善情況及不良反應(yīng)。移植后4、8、12周行對(duì)肝膽脾行CT、核磁共振(MRI)或彩超影像學(xué)檢查

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植成功率及不良反應(yīng) 21例患者均成功輸入HUCMSCs懸液，除2例有低熱外，無呼吸困難、靜脈炎等其他并發(fā)癥發(fā)生。

2.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 經(jīng)外周靜脈移植HUCMSCs后肝功指與移植前比較均有好轉(zhuǎn)(P＜0.05)，白細(xì)胞和血小板與移植前比較也有明顯改變(P＜0.05)。見表1、2。

表1HUCMSCs移植前后實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果n=21，±s

表1HUCMSCs移植前后實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果n=21，±s

注:與移植前比較，*P ＜0.05

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表2 HUCMSCs移植前后白細(xì)胞及血小板變化n=21，×109/L，±s

表2 HUCMSCs移植前后白細(xì)胞及血小板變化n=21，×109/L，±s

注:與移植前比較，*P ＜0.05

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2.3 癥狀、體征改善情況 移植后大部分患者的臨床癥狀和體征有所改善，12周時(shí)改善明顯。改善率分別為食欲改善15/21(71.4%)、精神好轉(zhuǎn) 16/21(76.2%)、體力增加 12/21(57.1%)、腹脹減輕 11/21(52.3%)、腹水減少或消失 11/21(52.3%)，下肢水腫減輕或消失 10/21(47.6%)。

2.4 術(shù)后影像學(xué)表現(xiàn) 移植后4、8、12周肝膽脾CT、核磁共振(MRI)或彩超影像學(xué)檢查結(jié)果顯示患者的左右肝葉大小和食道靜脈曲張無顯著改變。

3 討論

3.1 HUCMSCs作為干細(xì)胞治療肝硬化的可行性 肝細(xì)胞損傷后再生修復(fù)主要來源于三種細(xì)胞系，肝細(xì)胞、肝內(nèi)干細(xì)胞、肝外干細(xì)胞［1］。作為肝外干細(xì)胞源干細(xì)胞治療方法［2］，使用HUCMSCs移植治療終末期肝硬化正成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)HUCMSCs在體外適宜的條件下可向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在肝細(xì)胞生長因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子和其他細(xì)胞因子的刺激下，通過特殊的信號(hào)通路分化成形態(tài)、表型與肝細(xì)胞相似的細(xì)胞，并具備肝細(xì)胞的功能，移植后這些功能可以隨之轉(zhuǎn)移到受者［3］。間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新和擴(kuò)增的能力細(xì)胞，大量存在于臍帶，并可以從中提取并具有低免疫原性特征［4］。雖然骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療終末期肝硬化較早，由于骨髓抽取有創(chuàng)，增加了患者痛苦及治療過程的風(fēng)險(xiǎn)［5］。而HUCMSCs具有來源豐富、獲取無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，成為干細(xì)胞治療肝硬化的研究方向。21例患者輸入HUCMSCs懸液均獲得成功，低熱2例，無其他不良反應(yīng)，安全可行。

3.2 HUCMSCs移植治療效果 本組病例在選擇上除外了感染、活動(dòng)性上消化道出血、嚴(yán)重肝昏迷、肝腎綜合征、肝癌患者，為干細(xì)胞進(jìn)入人體后供較好的生長環(huán)境。從表1 HUCMSCs移植后肝功各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果可見，移植后4、8.12周ALT、TB下降與移植前比較明顯，PT移植后8、12周與移植前有顯著縮短，ALB、FBG在移植后4、8、12周顯著上升。以上指標(biāo)與移植前比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)。從表2可見患者外周血白細(xì)胞及血小板水平在移植后8、12周較術(shù)前上升明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用HUCMSCs經(jīng)外周靜脈移植治療肝硬化可明顯改善失代償期肝硬化患者的部分癥狀和體征，使實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)好轉(zhuǎn)。而對(duì)患者的肝臟的體積和食道靜脈曲張近期無改善。

3.3 間充質(zhì)干細(xì)胞移植途經(jīng)選擇 本組病例采用經(jīng)外周靜脈輸注移植，優(yōu)點(diǎn)是簡單、安全。但HUCMSCs要經(jīng)過全身血液循環(huán)才能到達(dá)肝臟，對(duì)肝臟定居分化的細(xì)胞數(shù)量可能會(huì)有影響。與經(jīng)股動(dòng)脈穿刺肝動(dòng)脈插管輸注相比，細(xì)胞未能直接到達(dá)肝臟，但輸入操作風(fēng)險(xiǎn)較小，并發(fā)癥發(fā)生率低，結(jié)果證實(shí)療效可靠。

3.4 HUCMSCs用于干細(xì)胞治療肝硬化的優(yōu)點(diǎn) HUCMSCs來源于臨床分娩后廢棄的臍帶，其來源廣泛，取材方便，數(shù)量充足。干/祖細(xì)胞更原始，增殖能力強(qiáng)，無致瘤性，易于控制病毒、病原微生物感染及傳播，無醫(yī)學(xué)倫理道德問題。經(jīng)處理后，可獲得大量的間充質(zhì)干細(xì)胞，可在體外大量擴(kuò)增并保持未分化狀態(tài)，免疫原性低，具有向肝細(xì)胞分化的潛能。

本研究從臨床角度證實(shí)HUCMSCs移植可以改善肝硬化患者的部分癥狀和體征及部分肝功能指標(biāo)，但由于研究的樣本小、指標(biāo)少、觀察時(shí)間短，HUCMSCs移植治療終末期肝硬化的長期療效及不良反應(yīng)還需要更多循證醫(yī)學(xué)的證實(shí)。

1 Weber A，Groyer-Picard MT，F(xiàn)ranco D，et al.Hepatocyte transplantation in animal models.Liver Transpl，2009，15:7-14.

2 Yagi K，Kojima M，Oyagi S，et al.Application of mesenchymal stem cells to liver regenerative medicine.Yakugaku Zasshi，2008，128:3-9.

3 Campard D，Lysy PA，Najimi M，et al.Native umbilical cord matrix stem cells express hepatic markers and differentiate into hepatocyte-like cells.Gastroenterology，2008，134:833-848.

4 任紅英，趙欽軍，邢文，等.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為有功能的低免疫原性肝細(xì)胞樣細(xì)胞.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，32:190-194.

5 Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived form adult marrow.Natur，2002，418:41-49.