李宏 李偉 王星冀 張金艷 郭秀娟 李麗 魏媛媛

研究表明，從細(xì)菌黏附定居、生長擴(kuò)散到宿主的生理失衡，均與不同種類的細(xì)胞因子有關(guān)［1］。本文對(duì)兩種菌落形態(tài)的鮑曼不動(dòng)桿菌的活菌菌懸液、培養(yǎng)上清液及菌體裂解液誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞表達(dá)白介素-8(IL-8)的能力進(jìn)行研究。目的在于初步探討鮑曼不動(dòng)桿菌引起肺癌細(xì)胞感染的機(jī)制，該菌是否能直接誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞表達(dá)IL-8從而引發(fā)炎性反應(yīng)，以及兩種表型的鮑曼不動(dòng)桿菌刺激細(xì)胞表達(dá)IL-8的能力是否有差別。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞來源 鮑曼不動(dòng)桿菌本室分離保存，A549細(xì)胞購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。

1.2 主要試劑 PRMI-1640，Gibco公司。胎牛血清，杭州四季青生物制品研究所。哥倫比亞瓊脂，法國生物梅里埃公司。Trizol，Invitrogen公司。RT試劑盒，F(xiàn)ermenters公司。PCR試劑盒，Promege公司。瓊脂糖，REGULAR公司。DNA marker，F(xiàn)ermenters公司。

1.3 儀器 低溫離心機(jī)20B型，日本HITACHISCR。7300 PCR擴(kuò)增儀，美國ABI。DF-CⅡ型水平電泳槽，北京東方。凝膠成像儀，美國FOTODYNE公司。

1.4 主要方法

1.4.1 活菌懸液制備:收集平板上過夜的細(xì)菌，將其懸于無雙抗無血清的RPMI-1640中并混勻，制備2×109cfu/ml的菌懸液，并依次稀釋10倍、100倍，使其終濃度為2×108cfu/ml、2×107cfu/ml。

1.4.2 菌體裂解液制備:分別將3個(gè)濃度的活菌懸液20 ml在冰浴下超聲(頻率為5 000 Hz)30 min，過濾除菌。

1.4.3 耗盡上清液的制備:250 ml的LB培養(yǎng)基中加入2×109cfu/ml的菌懸液2 ml，150 r/min震蕩培養(yǎng)72 h，離心取上清并過濾除菌。

1.4.4 細(xì)胞培養(yǎng):肺腺癌細(xì)胞 A549，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清，100 μg/L的鏈霉素和100 U/ml的青霉素，RPMI-1640。待其在25 cm2的培養(yǎng)瓶中長至單層(約2×106)，棄去培養(yǎng)基，用D-hank’液沖洗三遍，向其中加入2 ×109cfu/ml、2 ×108cfu/ml、2 ×107cfu/ml的菌懸液、菌體裂解液及培養(yǎng)上清液3 ml，與細(xì)胞共同孵育6、12、24 h。

1.4.5 人肺腺癌細(xì)胞總RNA的提取:細(xì)胞用D-hank’沖洗三遍。加入Trizol 1 ml，充分吹打后，將其移到無RNA酶的EP管中，于冰上靜置10 min。加入氯仿0.2 ml，加蓋，用力震蕩12 s后，冰上靜置5 min。4℃，10 800 r/min離心15 min。吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至另一無RNA酶的EP管中。在EP管中加入等量的異丙醇，加蓋，上下顛倒混勻，冰上靜置10 min，形成RNA沉淀。同上離心10 min，棄上清。加入0.4 ml 75%乙醇充分洗滌沉淀，4℃，8 550 r/min離心5 min，棄上清，將 RNA沉淀溶于40 μl無RNA酶的蒸餾水中。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，使 A260/A280 比值在1.8 ～2.0，并稀釋至1 μg/μl，于4 h內(nèi)進(jìn)行cDNA的合成。

1.4.6 cDNA的合成(逆轉(zhuǎn)錄):0.5 ml無 RNA 酶的微量離心管內(nèi)加入總 RNA 6 μl，oligo(dT)1 μl，DEPC 水 5 μl，于 70℃ 預(yù)熱5 min，迅速置冰上，離心數(shù)秒。加入5 × buffer 4 μl、dNTP Mix(10 mmol/L)2 μl、RNAnasin(20 U/μl)1 μl。37℃預(yù)熱5 min，迅速置冰上。再向微量離心管內(nèi)加入MMLV 1 μl。42℃恒溫60 min，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，70℃加熱10 min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性。

1.4.7 引物的合成:IL-8引物序列參考文獻(xiàn)［1］，上海生工生物工程公司合成。引物序列如下:

IL-8 5’-CGATGTCAGTGCATAAAGACA-3’ 200

5’-TGAATTCTCAGCCCTCTTCAAAAA-3＇β-actin 5’-AAATCGTGcGTGACATTAA-3＇ 472

5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3

1.4.8 PCR 擴(kuò)增:0.5 ml微量離心管內(nèi)加入 2 ×GoTaq Green Master Mix 12.5 μl，上游引物(10 μmol/L)2.5 μl、下游引物(10 μmol/L)2.5 μl、DNA 模板 2 μl、雙蒸水 5.5 μl。反應(yīng)條件為:94℃ 10 min，94℃ 1 min，53℃ 45s，72℃ 80 s，30 cycles，72℃10 min。內(nèi)參(β-actin)95℃ 5 min，94℃ 1 min，58℃ 45 s，72℃60 s，40 cycles，72℃ 10 min。

1.4.9 PCR產(chǎn)物定量分析:將擴(kuò)增產(chǎn)物4 μl上樣于1%瓊脂糖凝膠，1×TBE緩沖液，電壓80 V/cm。分析電泳結(jié)果，以待測(cè)細(xì)胞因子的光密度對(duì)同一標(biāo)本內(nèi)參(β-actin)光密度的比值表示該細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種鮑曼不動(dòng)桿菌活菌菌懸液及培養(yǎng)上清液與肺腺癌細(xì)胞IL-8表達(dá)比較 孵育后均只在24 h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)IL-8;粘液型的菌體裂解液在2×108cfu/ml時(shí)可以誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞表達(dá)IL-8，而在2×109cfu/ml、2×107cfu/ml時(shí)均不能誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞表達(dá)IL-8;非粘液型的菌體裂解液在各濃度則均不能誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞表達(dá)IL-8。見表1。

2.2 粘液型與非粘液型的活菌懸液誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞表達(dá) 粘液型在2×108cfu/ml時(shí)最強(qiáng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);非粘液型的活菌菌懸液誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞表達(dá)IL-8的能力隨著濃度的降低而增強(qiáng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

2.3 粘液型和非粘液型的菌液比較 2×108cfu/ml粘液型的活菌菌懸液較非粘液型的誘導(dǎo)表達(dá)IL-8能力強(qiáng)，培養(yǎng)上清液均較非粘液型的誘導(dǎo)表達(dá) IL-8能力弱，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

2.4 菌懸液與裂液比較 2×108cfu/ml的粘液表型的活菌菌懸液較菌體裂解液表達(dá) IL-8能力強(qiáng)，且具差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1粘液與非粘液鮑曼不動(dòng)桿菌IL-8的表達(dá)情況±s

表1粘液與非粘液鮑曼不動(dòng)桿菌IL-8的表達(dá)情況±s

注:與2 ×109菌懸液比較，*P ＜0.01;與2 ×108菌懸液比較，#P ＜0.01;與2×108菌懸液比較，△P ＜0.01

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3 討論

細(xì)胞因子通常是一組可溶性多肽、蛋白質(zhì)或糖蛋白，對(duì)細(xì)胞、組織和機(jī)體功能起調(diào)控作用。目前，主要將它劃分為六類，分別是白介素、細(xì)胞毒細(xì)胞因子、干擾素、集落刺激因子、生長因子、趨化因子。IL-8作為一種趨化因子，是一種強(qiáng)效的中性粒細(xì)胞趨化物質(zhì)，可將白細(xì)胞吸引到損傷、炎癥和感染部位。IL-8具有顯著的PMN趨化作用特異性，可在肺部積聚;IL-8釋放的增加是導(dǎo)致肺部感染中性粒細(xì)胞(PMNS)聚集最主要的原因［2，3］。

2種菌落的鮑曼不動(dòng)桿菌活菌菌懸液及培養(yǎng)上清液與肺腺癌細(xì)胞孵育后均只在24 h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)IL-8;粘液型的菌體裂解液在2×108cfu/ml時(shí)可以誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞表達(dá)IL-8，而在2×109cfu/ml、2×107cfu/ml時(shí)均不能誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞表達(dá)IL-8;非粘液表型的菌體裂解液在各濃度則均不能誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞表達(dá)IL-8。說明兩種菌落的鮑曼不動(dòng)桿菌活菌、分泌因子均可以吸引中性粒細(xì)胞的集聚誘發(fā)或加重感染;粘液型鮑曼不動(dòng)桿菌的菌體成分僅在2×108cfu/ml這個(gè)合適的濃度時(shí)才有可能參與該過程，非粘液型的鮑曼不動(dòng)桿菌的菌體成分則可能不參與該過程。

本研究粘液型菌懸液在高濃度2×109cfu/ml時(shí)刺激肺腺癌細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子IL-8，與非粘液型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明菌懸液濃度高時(shí)，不同型的菌株均可吸引大量中性粒細(xì)胞集聚造成損傷。

3個(gè)濃度為的兩種菌落形態(tài)的鮑曼不動(dòng)桿菌活菌菌懸液均能誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)IL-8的表達(dá)，IL-8隨著菌懸液、菌體裂解液濃度的降低呈增強(qiáng)趨勢(shì)。說明鮑曼不動(dòng)桿菌雖然可以誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞表達(dá)，但濃度過高的菌懸液中細(xì)菌(或菌體成分)較多，導(dǎo)致細(xì)胞最大程度的破碎，那么細(xì)胞表達(dá)的IL-8量也就較少。

粘液表型鮑曼不動(dòng)桿菌的菌體裂解液在2×108cfu/ml可誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞 IL-8的表達(dá)，在 2×108cfu/ml、2×107cfu/ml濃度時(shí)不能誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞IL-8的表達(dá)?？梢奍L-8的表達(dá)并非與菌體裂解液的濃度成正相關(guān)，而是存在一個(gè)最適濃度。

粘液表型的耗盡上清液(SCS)較非粘液表型的SCS誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞表達(dá)IL-8強(qiáng)，說明粘液表型的鮑曼不動(dòng)桿菌在代謝過程中可以產(chǎn)生較非粘液表型的鮑曼不動(dòng)桿菌更多的有生物活性的可溶性產(chǎn)物，其分泌因子的性質(zhì)和數(shù)量尚待進(jìn)一步探討。

3個(gè)濃度鮑曼不動(dòng)桿菌菌懸液較同濃度菌體裂解液誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞表達(dá)IL-8的能力強(qiáng)，說明鮑曼不動(dòng)桿菌誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞表達(dá)IL-8主要不是通過細(xì)菌或菌體成分與細(xì)胞膜受體分子的相互作用，而更加依賴于活菌對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，激活胞內(nèi)受體而起刺激作用。

1 Beck GC，Rafat N，Brinkkoetter P，et al.Hetero Geneity in lipoplysaccharide responsiveness of endothelial cells identified by Gene expression profiling:role of transcription factors.Clinical and Experimental Immunology，2006，143:523-533.

2 Luppi F，Longo AM，de Boer WI，et al.Interleukin-8 stimulates cell prolifertion in non-samll cell lung cancer through epidermal growth facter receptor transactivation.Lung Cancer，2007，56:25-33.

3 Araki S，Omori Y，Lyn D，et al.Interleukin-8 is a molecular determinant of androgen independence and progress in prostate cancer.Cancer Res，2007，67:6854-6862.