邱 娟，伍良涌（廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣州 510160）

沙利度胺為谷氨酸衍生物，最早作為鎮(zhèn)靜藥和鎮(zhèn)痛藥用于治療妊娠惡心、嘔吐，后因其嚴(yán)重的致畸和神經(jīng)毒性副作用而退出市場(chǎng)。研究[1]發(fā)現(xiàn)沙利度胺與抗麻風(fēng)病藥合用可以減少麻風(fēng)反應(yīng)，治療各型麻風(fēng)證如結(jié)節(jié)性紅斑。另有研究[2]發(fā)現(xiàn)沙利度胺對(duì)人類免疫缺陷病毒（HIV）感染、腫瘤引起的惡液質(zhì)、卡伯氏肉瘤、口腔潰瘍以及慢性移植物抗宿主反應(yīng)病等有療效。沙利度胺片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[3]中，但其標(biāo)準(zhǔn)中未收載有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)。國(guó)內(nèi)、外藥典中僅《美國(guó)藥典》收載其膠囊劑，筆者參考《美國(guó)藥典》沙利度胺膠囊劑項(xiàng)下有關(guān)物質(zhì)檢查方法[4]并結(jié)合國(guó)內(nèi)實(shí)際生產(chǎn)情況建立了準(zhǔn)確、可靠，且專屬性強(qiáng)的測(cè)定沙利度胺片有關(guān)物質(zhì)含量的高效液相色譜（HPLC）法，結(jié)果表明該法能夠很好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證用藥安全。由于本品在中性或堿性條件下易降解生成鄰苯二甲酸，因此采用鄰苯二甲酸作為有關(guān)物質(zhì)檢查的對(duì)照品。

1 儀器與試藥

1200型HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）。

沙利度胺標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào):100504-200501，純度:100.0%）、鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào):100903-200601，純度:100.0%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；沙利度胺片（常州制藥廠有限公司，批號(hào):0710081、07122714，規(guī)格:每片 25 mg；批號(hào):0710091、07111513，規(guī)格:每片50 mg）；乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters Nova-Pak C18（150 mm×3.9 mm，4 μm）；流動(dòng)相:水-乙腈-磷酸（梯度洗脫），水-乙腈-磷酸＝95∶5∶0.1為流動(dòng)相A，水-乙腈-磷酸＝85∶15∶0.1為流動(dòng)相B；梯度洗脫程序:0 min流動(dòng)相A為100%、流動(dòng)相B為0，0～15 min流動(dòng)相A由100%變?yōu)?0%、流動(dòng)相B由0變?yōu)?0%，15～20 min流動(dòng)相A由50%變?yōu)?00%、流動(dòng)相B由50%變?yōu)?，20～30 min流動(dòng)相A為100%、流動(dòng)相B為0，流速:2.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng):218 nm；柱溫:40 ℃；進(jìn)樣體積:200 μL。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

稱取沙利度胺標(biāo)準(zhǔn)品適量，加乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中含1 mg的溶液，作為溶液a；另取鄰苯二甲酸適量，用乙腈-水（80∶5）混合液溶解并定量稀釋制成每1 mL中含1 mg的溶液，精密量取適量，用乙腈稀釋制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，作為溶液b；精密量取溶液a、b各2 mL，置于同一100 mL量瓶中，用水-乙腈-磷酸（50∶50∶0.1）混合液稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL置于100 mL量瓶中，加入磷酸溶液（1→100）10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，沙利度胺峰的保留時(shí)間約為14 min，鄰苯二甲酸峰的相對(duì)保留時(shí)間約為0.3。色譜見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備:取沙利度胺片細(xì)粉適量（約相當(dāng)于沙利度胺0.1 g），精密稱定，置于50 mL量瓶中，加水-乙腈-磷酸（50∶50∶0.1）混合液適量，超聲振蕩使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)；精密量取續(xù)濾液10 mL置于100 mL量瓶中，加入磷酸溶液（1→100）10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability test

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:取鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，用乙腈-水（80∶5）混合液溶解并定量稀釋制成每1 mL中含1 mg的溶液，精密量取適量，用乙腈稀釋制成每1 mL中含0.1 mg的溶液；再精密量取2 mL，置于100 mL量瓶中，用水-乙腈-磷酸（50∶50∶0.1）混合液稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液10 mL置于100 mL量瓶中，加入磷酸溶液（1→100）10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3.3 空白輔料的制備:按處方比例制備不含沙利度胺的空白輔料，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備空白輔料溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液10 mL 5份分別用稀鹽酸溶液、10%氫氧化鈉溶液、30%過(guò)氧化氫溶液、365 nm紫外燈照射及沸水浴加熱進(jìn)行破壞后，進(jìn)樣測(cè)定，同時(shí)取未破壞供試品溶液進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，本品在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、高溫、光照等劇烈條件下均產(chǎn)生多個(gè)雜質(zhì)峰，對(duì)于強(qiáng)堿尤為敏感；建立的色譜條件對(duì)雜質(zhì)峰能進(jìn)行分離，色譜見圖2。

圖2 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of specification test

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1、2、5、10、15、20 mL，置于不同100 mL量瓶中，加10 mL磷酸溶液（1→100），加水定容至刻度，分別取各濃度溶液200 μL進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得鄰苯二甲酸回歸方程:Y＝466.998X－0.584（r＝0.999 9，n＝6），表明鄰苯二甲酸檢測(cè)濃度線性范圍為0.02～0.50 μg·mL－1。

2.6 精密度試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以鄰苯二甲酸峰面積計(jì)算RSD＝0.3%（n＝6）。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備批號(hào)為0710081的供試品6溶液份，進(jìn)樣、測(cè)定。結(jié)果樣品中最大單個(gè)雜質(zhì)含量的RSD＝1.5%（n＝6），雜質(zhì)總量的RSD＝1.0%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液分別在0、3、6、13、20 h測(cè)定，得沙利度胺峰面積的RSD＝0.1%，雜質(zhì)量未有明顯增加，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 檢出限

分別取沙利度胺標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，制成溶液，逐步稀釋進(jìn)樣，記錄色譜圖，以信噪比（S/N）＝3時(shí)的濃度計(jì)算得沙利度胺的檢出限為9 ng，鄰苯二甲酸的檢出限為1.2 ng。

2.10 樣品有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

分別稱取4批沙利度胺片各2份，照“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。在供試品溶液的色譜圖中，如有雜質(zhì)峰，按外標(biāo)法以鄰苯二甲酸峰面積計(jì)算。結(jié)果批號(hào)為0710081、07122714、0710091、07111513的樣品中最大單個(gè)雜質(zhì)含量分別為0.07%、0.09%、0.08%、0.09%，雜質(zhì)總量均為0.1%。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

從二極管陣列檢測(cè)器（DAD）記錄信號(hào)中提取鄰苯二甲酸、沙利度胺及沙利度胺主要降解產(chǎn)物在200～400 nm波長(zhǎng)的光譜圖，發(fā)現(xiàn)最大吸收基本在218 nm波長(zhǎng)附近，因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為218 nm。

本試驗(yàn)共考察了6種不同廠家牌號(hào)規(guī)格的色譜柱，分別為Welch Materials公司的Ultimate XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent公司的ZORBAX SB C18（150 mm×3.0 mm，3.5 μm），Waters公司的Nova-Pak C18（150 mm×3.9 mm，4 μm），迪馬公司的Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），Phenomenex公司的Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。除Nova-Pak C18及ZORBAX SB-C182種高效柱外，其他規(guī)格的普通色譜柱分析時(shí)間較長(zhǎng)，沙利度胺主峰的保留時(shí)間均在30 min以后，且峰形較差，理論板數(shù)較低。最終確定采用Waters公司的Nova-Pak C18，或者可采用同等柱效的色譜柱。

3.2 色譜條件的選擇

筆者采用文獻(xiàn)[5]報(bào)道的色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各色譜圖中主成分保留時(shí)間并不一致，且供試品檢出的雜質(zhì)處于2個(gè)溶劑峰之間，易受干擾，影響雜質(zhì)測(cè)定的準(zhǔn)確性。在專屬性考察中，采用該文獻(xiàn)的破壞條件未有較多雜質(zhì)檢出，且雜質(zhì)分離情況欠佳。本研究采用較為劇烈的的破壞條件（主要指酸、堿、氧化破壞試驗(yàn)中所用試劑的濃度均大于文獻(xiàn)報(bào)道所采用的濃度，光照及加熱破壞試驗(yàn)條件也強(qiáng)于文獻(xiàn)所述的條件）使得主成分沙利度胺產(chǎn)生明顯的降解產(chǎn)物，采用所建立的色譜條件均能使降解產(chǎn)物有較清晰的分離，并且空白輔料峰的保留時(shí)間均在1 min內(nèi)，從而避免了干擾其他雜質(zhì)峰的檢出。

3.3 進(jìn)樣體積的選擇

根據(jù)目前國(guó)內(nèi)實(shí)際生產(chǎn)情況，若按常規(guī)采用20 μL進(jìn)樣體積，雜質(zhì)檢出量較低，不能真實(shí)反映產(chǎn)品的質(zhì)量。曾嘗試制備濃度為2 mg·mL－1的供試品溶液而只進(jìn)樣20 μL，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙利度胺在水-乙腈-磷酸（50∶50∶0.1）混合液中的溶解性較差，無(wú)法完全溶解，影響沙利度胺片有關(guān)物質(zhì)的檢出。因此最終確定制備濃度為0.2 mg·mL－1的供試品溶液而選擇進(jìn)樣體積為200 μL，確保有關(guān)物質(zhì)檢查準(zhǔn)確、有效。

3.4 溶液的選擇

本研究參考《美國(guó)藥典》沙利度胺膠囊劑[4]項(xiàng)下方法，采用與流動(dòng)相相近組成比例的混合溶液溶解樣品，能夠避免出現(xiàn)較為明顯的溶劑峰。沙利度胺合成原料為鄰苯二甲酸酐和谷氨酸，沙利度胺在偏酸性條件下較穩(wěn)定，在中性或偏堿性條件下易分解，加入適量磷酸溶液可以避免樣品發(fā)生降解。

[1]徐浩翔.沙利度胺在皮膚科的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2009，25（11）:829.

[2]陳金月.沙利度胺的藥理作用與研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2004，23（3）:177.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)）第十一冊(cè)[S].北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:118.

[4]The United States Pharmacopeial Convention.The United States Pharmacopeia-The National Formulary（USP32-NF27）[S].Philadelphia:National Publishing，2008:3 704.

[5]歐貝麗，尹小英，徐菊芳，等.反相高效液相色譜法測(cè)定沙利度胺的有關(guān)物質(zhì)[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2008，43（6）:465.