陳 玲（貴州省藥品檢驗(yàn)所，貴陽(yáng) 550004）

羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液屬于殼聚糖類(lèi)衍生物，為無(wú)色或微黃、澄明、略有黏性的滅菌液體，用于人體皮膚及創(chuàng)面的修復(fù)，具有保護(hù)組織纖溶酶原激活物活性，減少滲出，保護(hù)、隔離、潤(rùn)滑組織創(chuàng)面及促進(jìn)愈合的作用，是一種外用噴涂、濕敷、沖洗液[1]。該液具有黏性，動(dòng)力黏度為1.2～3.0 mpa·s，且對(duì)生孢梭菌的作用較強(qiáng)，因此在建立無(wú)菌檢查方法時(shí)必須采用適宜的方法處理樣品液并消除其抗菌活性，以確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為此，筆者根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄無(wú)菌檢查法[2]，建立了該液的無(wú)菌檢查方法并進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 儀器與材料

1.1 儀器

智能集菌儀HTY-2000A（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）；PY330一次性使用全封閉集菌過(guò)濾培養(yǎng)器（以下簡(jiǎn)稱(chēng)集菌器，常州市政政生化設(shè)備有限公司，批號(hào):20100412）。

1.2 培養(yǎng)基

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號(hào):090104）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào):090104）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào):091124）、玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào):0909215）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào):090125）均為北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品，試驗(yàn)時(shí)均按要求[2]制備及滅菌。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]、白色念珠菌（Candida albicns）[CMCC（B）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.4 樣品

羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液（貴州揚(yáng)生醫(yī)用器械有限公司，批號(hào):20100701，規(guī)格:每瓶50 mL，含量:以D-鹽酸氨基葡萄糖計(jì)不低于1.3 mg·mL－1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品無(wú)菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

2.1.1 菌液的制備[2]。取經(jīng)35℃培養(yǎng)20 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 mL，生孢梭菌的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)物1 mL，分別用9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液（以下簡(jiǎn)稱(chēng)溶劑）10倍逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥?0～100 cfu·mL－1的菌液，備用。

取經(jīng)25℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌改良馬丁液體培養(yǎng)物1 mL，用9 mL溶劑10倍逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥?0～100 cfu·mL－1的菌液，備用。

取經(jīng)25℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加3～5 mL溶劑洗下霉菌孢子，吸取霉菌孢子懸液1 mL，用9 mL溶劑10倍逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥?0～100 cfu·mL－1的菌液，備用。

對(duì)所制備的菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.2 靈敏度檢查。取裝量為12 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9份，分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2份，另一份不接種，為陰性對(duì)照，置于30～35℃培養(yǎng)3 d；另取裝量為12 mL改良馬丁培養(yǎng)基5份，分別接種白色念珠菌、黑曲霉各2份，另一份不接種，為陰性對(duì)照，置于23～28℃培養(yǎng)5 d，逐日觀察。結(jié)果培養(yǎng)基的靈敏度檢查均符合規(guī)定，詳見(jiàn)表2（“+”:表示有菌生長(zhǎng)；“-”:表示無(wú)菌生長(zhǎng)，下表同）。

表1 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果Tab 1 Results of bacterial colony count

2.1.3 方法學(xué)驗(yàn)證Ⅰ[3]。取集菌器，第1個(gè)濾筒按薄膜過(guò)濾法濾過(guò)樣品5瓶，然后將相應(yīng)的培養(yǎng)基及試驗(yàn)菌加入濾筒中，作為試驗(yàn)管；第2個(gè)濾筒不濾樣品，直接加入相應(yīng)的培養(yǎng)基及試驗(yàn)菌，作為陽(yáng)性對(duì)照管；第3個(gè)濾筒直接加入相應(yīng)的培養(yǎng)基，作為陰性對(duì)照管。6種試驗(yàn)菌同法操作，置于規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，逐日觀察，各試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。

表3 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果（Ⅰ）Tab 3 Results of methodology validation（Ⅰ）

表3結(jié)果顯示，方法學(xué)驗(yàn)證Ⅰ中，直接薄膜過(guò)濾法驗(yàn)證6種菌，生孢梭菌試驗(yàn)管無(wú)菌生長(zhǎng)，白色念珠菌試驗(yàn)管到第5天才有少量菌生長(zhǎng)，而其他4種菌無(wú)論試驗(yàn)管還是陽(yáng)性對(duì)照管都生長(zhǎng)良好，說(shuō)明樣品對(duì)生孢梭菌、白色念珠菌有抑菌作用，因此需進(jìn)一步作驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.1.4 方法驗(yàn)證Ⅱ。針對(duì)被抑制試驗(yàn)菌的情況，采用沖洗方法消除樣品對(duì)生孢梭菌、白色念珠菌的抑制作用。取集菌器，先用0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液浸濕濾筒，第1筒取樣品5瓶濾過(guò)，然后用500 mL 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液分5次沖洗，沖洗時(shí)充分振搖，在最后一次的沖洗液中加入生孢梭菌菌液1 mL，濾過(guò)，抽干，然后加入相應(yīng)的培養(yǎng)基100 mL，作為試驗(yàn)管；同時(shí)第2筒、第3筒為陽(yáng)性、陰性對(duì)照管。白色念珠菌同法操作。置于規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，逐日觀察。結(jié)果，生孢梭菌試驗(yàn)管仍未見(jiàn)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明樣品對(duì)其仍有抑菌作用。各試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況見(jiàn)表4。

2.1.5 方法驗(yàn)證Ⅲ。針對(duì)被抑制生孢梭菌的情況，采用加熱沖洗液沖洗的方法以消除樣品對(duì)生孢梭菌的抑制作用，其中沖洗液取量分別為500、800 mL。

表4 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果（Ⅱ）Tab 4 Results of methodology validation（Ⅱ）

取集菌器，先用加熱至45℃的0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液浸濕濾筒，第1筒取樣品5瓶濾過(guò)，用每膜500 mL、加熱至45℃的0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液分5次沖洗，沖洗時(shí)充分振搖，在最后一次的沖洗液中加入生孢梭菌菌液1 mL，濾過(guò)，抽干，然后加入相應(yīng)的培養(yǎng)基100 mL，作為試驗(yàn)管；第2、3筒為陽(yáng)性、陰性對(duì)照管。另取集菌器同法進(jìn)行試驗(yàn)，只是沖洗液取量為800 mL。置于規(guī)定溫度培養(yǎng)1～3 d，逐日觀察，試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況見(jiàn)表5。

表5 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果（Ⅲ）Tab 5 Results of methodology validation（Ⅲ）

方法驗(yàn)證Ⅲ結(jié)果說(shuō)明，采用加熱至45℃的0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液500、800 mL沖洗，均可消除樣品對(duì)生孢梭菌的抑制作用。

2.2 樣品無(wú)菌檢查

確定羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液無(wú)菌檢查方法為:取集菌器，先用加熱至45℃的0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液浸濕，取樣品5瓶，濾過(guò)，用加熱至45℃的0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液500 mL（每膜），分5次沖洗，再將相應(yīng)的培養(yǎng)基100 mL加入濾筒內(nèi)，以生孢梭菌為陽(yáng)性對(duì)照菌，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)14 d，逐日觀察、記錄。取樣品按照上述方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品無(wú)菌檢查驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 6 Sterility validation test results of sample

表6結(jié)果顯示，羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液采用加熱至45℃的0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液500 mL沖洗（每膜），完全能消除其對(duì)生孢梭菌的抑制作用，試驗(yàn)管中各試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，可作為羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液的無(wú)菌檢查方法。

羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液為貴州揚(yáng)生醫(yī)用器械有限公司生產(chǎn)，報(bào)貴州省藥品檢驗(yàn)所注冊(cè)檢驗(yàn)，該樣品為上市制劑。目前未見(jiàn)有關(guān)該類(lèi)外用沖洗液無(wú)菌檢查方法的報(bào)道。根據(jù)《中國(guó)藥典》相關(guān)要求[2]，羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液屬非注射產(chǎn)品，批產(chǎn)量＞200，每種培養(yǎng)基最少檢驗(yàn)數(shù)量為10個(gè)，因此取樣品60瓶，按上法作6種菌的無(wú)菌檢查試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 批產(chǎn)量樣品無(wú)菌檢查法驗(yàn)證結(jié)果Tab 7 Results of sterility validation of batch production of samples

表7結(jié)果顯示，按批出廠產(chǎn)品最少檢驗(yàn)數(shù)量為10個(gè)，而上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量為5個(gè)，雖然批出廠產(chǎn)品檢驗(yàn)數(shù)量是上市樣品檢驗(yàn)數(shù)量的2倍，但在檢驗(yàn)過(guò)程中使用加熱后的沖洗液浸潤(rùn)濾膜，且沖洗分5次，沖洗時(shí)要充分振搖，同樣能消除樣品的抑菌作用。

3 討論

根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄無(wú)菌檢查法的要求[2]，薄膜過(guò)濾法為首選方法。薄膜過(guò)濾法采取封閉式集菌，供試品取量大，不易漏檢，抽濾前的消毒及無(wú)菌操作也容易控制，故本試驗(yàn)選擇薄膜過(guò)濾法。

羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液具有一定的抗菌作用，且具黏性，無(wú)菌檢查時(shí)，必須采用加熱至45℃的沖洗液沖洗，此溫度沖洗液沖洗樣品，既不會(huì)使濾膜上的微生物受損傷，又能消除其抑菌作用。

[1]貴州揚(yáng)生醫(yī)用器材有限公司.羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液說(shuō)明書(shū)[S].2010.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄103-107.

[3]郭朝暉，何曉英，歐陽(yáng)曉玫.注射用夫西地酸鈉無(wú)菌檢查方法的建立及驗(yàn)證[J].中國(guó)藥房，2011，22（5）:453.