李六水，高燕，李忠東#（1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥3003；.空軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京10014）

慶大霉素是臨床上常用的氨基糖苷類抗生素（AGs）之一，廣泛用于革蘭陰性桿菌感染的治療，其主要作用特點(diǎn)是隨劑量的增加，其抗菌效果增強(qiáng)。目前，由于臨床上耐藥菌多見，慶大霉素等抗菌藥物的使用劑量越來越大，這無疑又加重了其不良反應(yīng)的發(fā)生，如慶大霉素的腎毒性等。如何預(yù)防慶大霉素隨劑量增加所致的毒性增強(qiáng)，是藥物靶器官毒性防治領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一。細(xì)胞色素C（Cytochrome C）是從豬心中提取的含鐵卟啉的細(xì)胞呼吸激動(dòng)藥，臨床上廣泛用于各種組織缺氧的急救或輔助治療，如一氧化碳中毒、安眠藥中毒、嚴(yán)重休克期缺氧以及肺部疾病引起的呼吸困難和心肌缺氧的治療等[1]。Watanabe A等[2]以同位素示蹤的方法發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素C 0.8、8、80 mg·kg－1與低劑量慶大霉素0.1 mg·kg－1單次聯(lián)合給藥后2 h，大鼠腎臟中慶大霉素蓄積的量比對(duì)照組分別減少了約3.5%、35.7%、67.9%；細(xì)胞色素C 100 mg·kg－1可顯著降低慶大霉素30 mg·kg－1所致大鼠尿液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）的量。由于目前慶大霉素的臨床用量越來越大，因此本研究在Watanabe A等研究基礎(chǔ)上，利用AxSYM全自動(dòng)免疫分析儀，根據(jù)熒光偏振免疫發(fā)光技術(shù)（FPIA）原理測(cè)定了慶大霉素的含量，觀察細(xì)胞色素C 100 mg·kg－1對(duì)高劑量慶大霉素100 mg·kg－1單次給藥后在大鼠腎臟中蓄積量的影響，并觀察細(xì)胞色素C對(duì)慶大霉素致大鼠腎小管上皮細(xì)胞毒性的影響，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（北京航空航天大學(xué)研究開發(fā)，由空軍總醫(yī)院孟如松教授提供，已獲北京市醫(yī)療器械準(zhǔn)產(chǎn)許可證，注冊(cè)號(hào):京藥管械（準(zhǔn)）字2001第2210233號(hào)；已被廣泛用于圖像分析[3]）；AxSYM全自動(dòng)免疫分析儀（美國Abbott公司）；DY89-Ⅱ電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

細(xì)胞色素C注射液（安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司，批號(hào):100944，規(guī)格:15 mg∶2 mL）；硫酸慶大霉素注射液（廣州白云山天心制藥股份有限公司，批號(hào):101136，規(guī)格:8萬u∶2 mL）；AxSYM慶大霉素檢測(cè)試劑盒、AxSYM慶大霉素定標(biāo)液、Ax-SYM慶大霉素質(zhì)控液（美國Abbott公司，批號(hào):93021、92476、90247）；脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端原位標(biāo)記（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（瑞士羅氏公司，批號(hào):12176400）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康Wistar大鼠30只，♂，體重180～200 g，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK（軍）2007-004。

2 方法

2.1 分組與給藥

將所有大鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝食與飲水，室溫25℃左右，相對(duì)濕度55%左右。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后隨機(jī)分為溶媒對(duì)照組、慶大霉素組、慶大霉素+細(xì)胞色素C組，每組10只。溶媒對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，慶大霉素組腹腔注射慶大霉素100 mg·kg－1·d－1，慶大霉素+細(xì)胞色素C組先尾靜脈注射細(xì)胞色素C 100 mg·kg－1·d－1，約30 min后腹腔注射慶大霉素100 mg·kg－1·d－1。

2.2 腎臟標(biāo)本采集與處理

單劑量給藥后24 h處死大鼠，迅速剖腹摘取雙側(cè)腎臟，用生理鹽水洗凈表面殘血，并用濾紙吸干表面水分。每只大鼠的左腎稱重后加入生理鹽水，用組織勻漿機(jī)制備成6 mL的腎組織勻漿，用于測(cè)定腎臟中藥物濃度。每只大鼠右腎經(jīng)縱切大致均分為2個(gè)部分，1/2用生理鹽水濕潤(rùn)的紗布包裹后置于－20℃中儲(chǔ)存，用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)；另1/2置于4%中性甲醛溶液中固定，用于組織病理學(xué)觀察。

2.3 腎組織中慶大霉素的含量測(cè)定

將制備好的腎組織勻漿置于振蕩器上渦旋混勻，取40 μL勻漿，加生理鹽水稀釋10倍，10 000 r·min－1離心10 min，取上清液置于AxSYM樣品杯中，以AxSYM全自動(dòng)免疫分析儀測(cè)定腎組織中慶大霉素的含量，重復(fù)3次，并同時(shí)測(cè)定AxSYM慶大霉素高、中、低3個(gè)質(zhì)控液濃度。如果3個(gè)質(zhì)控液濃度均在允許范圍內(nèi)，則樣品測(cè)定結(jié)果符合要求，然后將每組大鼠的檢測(cè)結(jié)果折算成每克腎組織含慶大霉素的質(zhì)量（μg·g－1）。

2.4 腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況

采用TUNEL法檢測(cè)各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡，在400倍熒光顯微鏡（激發(fā)光波長(zhǎng)450～500 nm）下觀察凋亡陽性細(xì)胞，呈現(xiàn)綠色顆粒狀細(xì)胞判定為凋亡陽性細(xì)胞。具體操作方法嚴(yán)格按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 腎小管上皮細(xì)胞凋亡圖像分析

在每張大鼠腎組織切片組織區(qū)域劃定一個(gè)大小幾乎相等的長(zhǎng)方形亞區(qū)域，在4個(gè)角和中心區(qū)5個(gè)視野采集圖像，用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)密度（單位統(tǒng)計(jì)場(chǎng)面積內(nèi)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)密度＝凋亡陽性細(xì)胞總個(gè)數(shù)/統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積）。

2.6 腎組織病理學(xué)變化

將中性甲醛溶液固定的大鼠腎組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，在400倍光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理學(xué)變化，每張切片選取5個(gè)不重疊視野，采集圖片觀察。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 慶大霉素的含量變化

結(jié)果表明，慶大霉素組大鼠腎組織中慶大霉素含量為（335.16±99.18）μg·g－1；慶大霉素+細(xì)胞色素C組大鼠腎組織中慶大霉素含量為（221.67±71.12）μg·g－1。與慶大霉素組比較，慶大霉素+細(xì)胞色素C組大鼠腎組織中慶大霉素蓄積量降低了33.86%（P＝0.043＜0.05）。

3.2 腎小管上皮細(xì)胞凋亡變化

結(jié)果表明，溶媒對(duì)照組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)較少，慶大霉素組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，慶大霉素+細(xì)胞色素C組較慶大霉素組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)有所減少。3組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)密度分別為（111.26±95.35）、（637.78±169.64）、（404.75±135.57）n·mm－2。與溶媒對(duì)照組比較，慶大霉素組腎小管上皮細(xì)胞凋亡的陽性細(xì)胞數(shù)密度明顯增加（P＜0.01）；與慶大霉素組比較，慶大霉素+細(xì)胞色素C組腎小管上皮細(xì)胞凋亡的陽性細(xì)胞數(shù)密度減少了36.53%（P＜0.05）。各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的陽性細(xì)胞數(shù)密度比較見圖1。

圖1 各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的切片圖（×400）Fig 1 Slices chart of rat renal tubular epithelial cells apoptosis（×400）

3.3 腎組織病理學(xué)變化

結(jié)果表明，溶媒對(duì)照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)清楚，腎小球無明顯充血或腫脹；慶大霉素組大鼠腎小管上皮細(xì)胞水腫、空泡變性，細(xì)胞刷狀緣脫落，腎間質(zhì)內(nèi)可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見腎小球充血腫脹；慶大霉素+細(xì)胞色素C組大鼠腎組織病變程度較慶大霉素組明顯減輕。各組大鼠腎臟組織病理學(xué)切片見圖2。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)切片（×400）Fig 2 Pathological slices of rat kidneys（×400）

4 討論

腎小管上皮細(xì)胞是慶大霉素毒性靶細(xì)胞[4]。Mouedden ME等[5]用TUNEL染色法和甲基綠-派洛寧染色法證實(shí)，慶大霉素10 mg·kg－1·d－1連續(xù)腹腔注射給藥4 d后，可以導(dǎo)致大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡；劉冬娟等[6]通過給大鼠腹腔注射慶大霉素100 mg·kg－1·d－1，分別連續(xù)給藥5、8、10 d后，在透射電鏡下均觀察到腎小管上皮細(xì)胞凋亡。本研究以高劑量慶大霉素100 mg·kg－1·d－1單次腹腔注射給藥后，采用TUNEL法也明顯觀察到大鼠腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，提示腎小管上皮細(xì)胞凋亡可能是慶大霉素腎毒性的主要機(jī)制。

目前已證實(shí)，慶大霉素主要與腎小管上皮細(xì)胞膜表面的Megalin受體結(jié)合，然后通過胞飲方式進(jìn)入并蓄積于腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)[7]。Megalin受體是一種低密度脂蛋白受體[2]，在腎小管上皮細(xì)胞表面大量表達(dá)[8]，其有多種配體，如多粘菌素B、胰島素、血紅蛋白、Ca2+、細(xì)胞色素C等[9]。Schmitz C等[10]發(fā)現(xiàn)，Megalin受體缺失型小鼠腎皮質(zhì)中蓄積的慶大霉素的量?jī)H為給藥劑量的0.6%，且胃腺癌細(xì)胞（AGs）與Megalin受體的親和力越大，則發(fā)生腎毒性的可能性越大，提示阻斷慶大霉素與該受體的結(jié)合即可抑制慶大霉素的腎毒性。

本研究通過測(cè)定大鼠腎臟中慶大霉素的藥物濃度，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素C 100 mg·kg－1·d－1與高劑量慶大霉素100 mg·kg－1·d－1聯(lián)用后，腎組織中慶大霉素的蓄積量比單用慶大霉素減少了33.86%。此外，本研究還表明，細(xì)胞色素C與慶大霉素聯(lián)用后，腎小管上皮細(xì)胞凋亡的陽性細(xì)胞數(shù)減少了36.53%（P＜0.05），而且腎組織病理學(xué)變化有所好轉(zhuǎn)，表明其原因可能為外源性給予的細(xì)胞色素C抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡的程度與其阻斷腎組織中慶大霉素蓄積的程度相匹配；同時(shí)說明外源性給予的細(xì)胞色素C不能透過正常細(xì)胞的細(xì)胞膜[11]，不能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但結(jié)合并占據(jù)細(xì)胞膜表面的Megalin受體，從而競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷慶大霉素與Megalin受體的結(jié)合，使腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)慶大霉素的蓄積量減少。

總之，本研究從3個(gè)角度即腎組織藥物濃度測(cè)定、腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測(cè)和組織病理學(xué)觀察證明，細(xì)胞色素C可能通過抑制慶大霉素在大鼠腎臟中的蓄積來減輕其腎毒性。

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