王淑娟，高燕霞，程桂茹（.長春工業(yè)大學(xué)，長春3002；2.河北省藥品檢驗(yàn)所，石家莊0500）

麥迪霉素為一組16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的混合物，是日本的Takashi公司1971年從日本土壤中分離出來的生米加鏈霉菌（Streptomyces mycarofaciens）ATCC 21454經(jīng)發(fā)酵提取分離制得的。其抗菌作用稍低于紅霉素，臨床主要用于革蘭陽性菌感染。乙酰麥迪霉素為麥迪霉素的2個(gè)位點(diǎn)上的羥基經(jīng)乙酰化所得的一種二乙?；衔?，對(duì)革蘭陽性球菌有較強(qiáng)的抗菌活性，口服吸收良好，血藥濃度高，無苦味，具有很好的制劑學(xué)優(yōu)點(diǎn)。乙酰麥迪霉素的體外活性與麥迪霉素基本相同，但體內(nèi)活性卻顯著優(yōu)于麥迪霉素，原因之一可能是由于分子結(jié)構(gòu)中增加了2個(gè)乙?；蛊涿擋；x變緩、體內(nèi)濃度增加所致。

目前，乙酰麥迪霉素采用管碟法測定其含量[1～3]。管碟法能直觀反映樣品的體外抗菌能力，尤其對(duì)于單純化學(xué)方法難以分開的多組分抗生素來說，一直被廣泛應(yīng)用。但同時(shí)因其操作煩瑣、影響因素多，而使結(jié)果的準(zhǔn)確性有待商榷。采用濁度法測定則可克服上述不足之處[4，5]。筆者建立了以濁度法測定乙酰麥迪霉素制劑效價(jià)的方法，并與管碟法比較。通過對(duì)乙酰麥迪霉素用濁度法測定其效價(jià)的研究，可以進(jìn)一步提高產(chǎn)品效價(jià)測定的準(zhǔn)確性，有效地減少了誤差。同時(shí)，濁度法作為效價(jià)檢測的方法，不但可反映抗菌能力的高低，且具有更直觀的效果。

1 儀器與試藥

WBS-100全自動(dòng)微生物比濁法測定儀、石英培養(yǎng)杯（厚度2 cm）（北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司）；CBZ-1抗生素光度比濁法測量儀、石英培養(yǎng)杯（厚度1 cm）（北京潮聲公司）；CAM-ⅢA智能抑菌圈測定儀（上海波浦新材料技術(shù)有限公司）。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、乙酰麥迪霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào):130362-200301，純度:998 u·mg－1）均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙酰麥迪霉素片（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號(hào):114080401、6114090201，規(guī)格:每片0.1 g（10萬u））；乙酰麥迪霉素干混懸劑（沈陽第一制藥廠，批號(hào):080308，規(guī)格:0.1 g∶0.5 g，1萬u）；抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ號(hào)（pH7.0，批號(hào):080501）、抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅷ號(hào)（批號(hào):080301）均由北京三藥科技開發(fā)公司提供，中國食品藥品檢定研究院監(jiān)制；滅菌0.9%氯化鈉溶液和磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH4.5）均按《中國藥典》2010年版二部附錄[6]制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 管碟法[1～3]

2.1.1 菌液的制備。

取枯草芽孢桿菌的試驗(yàn)菌液[6]0.2 mL加至培養(yǎng)基Ⅷ號(hào)（另加0.3%酵母浸出粉，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.8～8.0）100 mL中，搖勻，為實(shí)驗(yàn)菌液。

2.1.2 溶液的制備。

（1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取乙酰麥迪霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，加乙醇溶解并稀釋成500 u·mL－1的溶液，作為儲(chǔ)備液備用；精密量取儲(chǔ)備液適量，用PBS進(jìn)一步稀釋成20、40 u·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

（2）供試品溶液。取乙酰麥迪霉素片10片，研細(xì)，精密稱取適量，加乙醇適量，充分振搖使溶解，再用乙醇稀釋制成500 u·mL－1的溶液，靜置，作為儲(chǔ)備液備用；精密量取儲(chǔ)備液適量，用PBS進(jìn)一步稀釋成20、40 u·mL－1的供試品溶液a。取乙酰麥迪霉素干混懸劑20包，混合均勻，精密稱取適量，加乙醇適量，充分振搖使溶解，再用乙醇稀釋制成500 u·mL－1的溶液，靜置，作為儲(chǔ)備液備用；精密量取儲(chǔ)備液適量，用PBS進(jìn)一步稀釋成20、40 u·mL－1的供試品溶液b。

2.1.3 培養(yǎng)與測定。

按照管碟法二劑量法進(jìn)行試驗(yàn)。在抑菌圈電腦測量分析儀上測量并計(jì)算結(jié)果，即得乙酰麥迪霉素片及干混懸劑的含量。

2.2 濁度法[6]

2.2.1 試驗(yàn)菌、培養(yǎng)基及加菌量的選擇。

乙酰麥迪霉素為廣譜抗生素，對(duì)革蘭陽性菌及陰性菌均有很好的抗菌作用，同時(shí)選擇金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌為試驗(yàn)菌，培養(yǎng)基為抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ號(hào)。

在WBS-100全自動(dòng)微生物比濁法測定儀上，選擇肺炎克雷伯菌為試驗(yàn)菌，加菌量為2.5%，抗生素濃度為3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 u·mL－1；測定后繪制乙酰麥迪霉素不同濃度及陽性對(duì)照的時(shí)間-吸光度曲線（生長曲線），詳見圖1。

圖1 肺炎克雷伯菌為試驗(yàn)菌時(shí)乙酰麥迪霉素的生長曲線Fig 1 Growth curves of acetyl midecamycin with K.peumoniae as test organism

在CBZ-1抗生素光度比濁法測量儀上，選擇金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌，加菌量為1.2%，抗生素濃度為0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 u·mL－1；測定后繪制乙酰麥迪霉素不同濃度及陽性對(duì)照的時(shí)間-吸光度曲線（生長曲線），詳見圖2。

對(duì)比圖1、圖2可知，采用肺炎克雷伯菌作為試驗(yàn)菌，乙酰麥迪霉素的抗菌濃度范圍較窄，到達(dá)平臺(tái)期較早（180 min，3 h左右），曲線斜率較小，乙酰麥迪霉素的濃度較金黃色葡萄球菌時(shí)為高，這些都說明乙酰麥迪霉素對(duì)金黃色葡萄球菌更為敏感，所以最終采用金黃色葡萄球菌作為本實(shí)驗(yàn)的菌種。

圖2 金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌時(shí)乙酰麥迪霉素的生長曲線Fig 2 Growth curves of acetyl midecamycin with S.aureus as test organism

2.2.2 一劑量法。

（1）菌液的制備。取金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，在35～37℃培養(yǎng)20～22 h，臨用時(shí)，用0.9%滅菌氯化鈉溶液洗下；取新鮮的菌懸液適量，加12%甲醛液1 mL殺滅，以生理鹽水稀釋，使得其在530 nm波長處的吸光值為1.0，記錄其稀釋所用的生理鹽水的毫升數(shù)和1 mL12%甲醛液的總毫升數(shù)，再將原菌液按此比例稀釋，即為試驗(yàn)菌液。取試驗(yàn)菌液1.2～2.5 mL加至培養(yǎng)基100 mL中，搖勻，為實(shí)驗(yàn)菌液。

（2）溶液的制備。①標(biāo)準(zhǔn)品溶液:精密量取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，用PBS進(jìn)一步稀釋成0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 u·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。②供試品溶液c:精密量取供試品儲(chǔ)備液a適量，用PBS進(jìn)一步稀釋成1.5 u·mL－1的供試品溶液。③供試品溶液d:精密量取供試品儲(chǔ)備液b適量，用PBS進(jìn)一步稀釋成1.5 u·mL－1的供試品溶液。

（3）培養(yǎng)與測定。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液c各1.0 mL，加入滅菌培養(yǎng)管中，再加入實(shí)驗(yàn)菌液9.0 mL，置于抗生素光度比濁法測量儀內(nèi)，于37℃培養(yǎng)；另取PBS 1.0 mL，加9.0 mL空白培養(yǎng)基，混勻，作為空白對(duì)照。儀器在線于530 nm波長處測定各管金黃色葡萄球菌對(duì)數(shù)生長期內(nèi)不同培養(yǎng)時(shí)間（實(shí)時(shí)記錄，從0開始到5 h左右）下的吸光度值，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理計(jì)算供試品的效價(jià)值。同法測定供試品溶液d。

2.2.3 二劑量法。

（1）溶液的制備。①標(biāo)準(zhǔn)品溶液:精密量取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，用PBS進(jìn)一步稀釋成1.0、2.0 u·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；②供試品溶液e:精密量取供試品儲(chǔ)備液a適量，用PBS進(jìn)一步稀釋成1.0、2.0 u·mL－1的供試品溶液；③供試品溶液f:精密量取供試品儲(chǔ)備液b適量，用PBS進(jìn)一步稀釋成1.0、2.0 u·mL－1的供試品溶液。（2）菌液的制備、培養(yǎng)與測定均同一劑量法相關(guān)操作。

2.2.4 線性范圍的測定。

照抗生素微生物檢定一劑量法測定，并按“2.2.2”項(xiàng)下各組濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所制菌液吸光度的值（y）對(duì)溶液對(duì)數(shù)濃度（x）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)為y＝－4.048 8×10－1x+5.670 7×10－1（r＝0.998 3）。結(jié)果表明，采用標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行一劑量法試驗(yàn)，乙酰麥迪霉素檢測濃度線性范圍為0.3～3.0 u·mL－1。

2.2.5 回收率試驗(yàn)。

精密稱取乙酰麥迪霉素標(biāo)準(zhǔn)品及已知含量的片劑樣品和干混懸劑樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液a和供試品溶液b的儲(chǔ)備液，得3種溶液濃度均為400、500、600 u·mL－1的溶液，備用；分別等量精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液a和b儲(chǔ)備液適量，用PBS稀釋制成0.8和1.6 u·mL－1、1.0和2.0 u·mL－1、1.2和2.4 u·mL－1的供試品溶液（分別代表80%、100%和120%3種水平，每種溶液的終溶液再稀釋為2種濃度共6個(gè)溶液，進(jìn)行二劑量法的測定）于儀器上測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，片劑平均回收率為101.99%，RSD＝1.9%（n＝9）；干混懸劑平均回收率為101.68%，RSD＝1.68%（n＝9），詳見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)測定結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.2.6 適用性考察。

將乙酰麥迪霉素制劑按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品貯備液及供試品溶液，分別在冰箱保存5、2 d，每天照“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，并計(jì)算當(dāng)天效價(jià)。結(jié)果，供試品貯備液和供試品溶液的效價(jià)的RSD均小于1.5%，表明乙酰麥迪霉素制劑的貯備溶液和進(jìn)樣用測定溶液分別在冰箱保持5 d和2 d內(nèi)穩(wěn)定，完全滿足試驗(yàn)需要。

2.2.7 樣品效價(jià)測定。

取乙酰麥迪霉素制劑共3批，按“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。并將結(jié)果與原方法（即管碟法）進(jìn)行比較。結(jié)果表明，本方法結(jié)果與管碟法結(jié)果無顯著性差異，具體見表2。

表2 2種方法效價(jià)測定結(jié)果比較Tab 2 Comparison of antimicrobial activity of two methods

2.2.8 2種方法的數(shù)據(jù)檢驗(yàn)。

采用成對(duì)觀測的t檢驗(yàn)[7]，由表2可計(jì)算出3批制劑的2種方法效價(jià)差值d的平均值為－0.9%，標(biāo)準(zhǔn)偏差s為－1.058 3%，需要的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量t為:

當(dāng)自由度為2、水平為5%的│t│的臨界值是4.303，由于1.473＜4.303，因而可認(rèn)為2種方法的效價(jià)測定結(jié)果基本一致，2種方法均可控制藥品質(zhì)量。

3 討論

乙酰麥迪霉素采用管碟法測定效價(jià)時(shí)，抗生素檢測濃度線性范圍均為5～40 u·mL－1[1，2]，本文采用濁度法測定效價(jià)時(shí)，抗生素線性范圍為0.3～3.0 u·mL－1，說明采用濁定法具有更低的檢測限、更高的靈敏度，表現(xiàn)更直觀。本文所建立的濁度法，通過“2.2.1”項(xiàng)下的比對(duì)結(jié)果，采用更為敏感的金黃色葡萄球菌作為試驗(yàn)用菌，不僅方法更靈敏，可信限率也大大降低；而方法可靠性增加后，必然會(huì)使結(jié)果的準(zhǔn)確性得以提高。

由于乙酰麥迪霉素為16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是由A1、A2～A4、柱晶白霉素A6等組分組成的混合物，受發(fā)酵菌種和生產(chǎn)工藝的影響，各組分含量比例變化不定。所以在化學(xué)方法越來越占分析主流的今天，多組分抗生素仍采用生物測定法進(jìn)行含量測定。但采用管碟法測定效價(jià)時(shí)，受擴(kuò)散系數(shù)、培養(yǎng)基黏稠度、抑菌圈大小等諸多因素影響，因此測定誤差較大。濁度法測定在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，可避免上述因素的影響；用固定波長測定菌液的吸光度，精密度優(yōu)于管碟法中對(duì)抑菌圈的測定，且培養(yǎng)時(shí)間短，因此測定更為快速、準(zhǔn)確。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用管碟法測定乙酰麥迪霉素制劑的效價(jià)時(shí)，樣品制備時(shí)貯備液幾乎都是采用乙醇進(jìn)行溶解，到終溶液時(shí)用緩沖液來稀釋，這樣終溶液中乙醇的濃度達(dá)到了8%。因?yàn)樵摲椒ㄊ乾F(xiàn)行方法，所以筆者未對(duì)該方法進(jìn)行修改。同時(shí)，為便于比較管碟法和濁度法，筆者沿用了標(biāo)準(zhǔn)中溶液制備的方法。

經(jīng)濁度法與管碟法測定效價(jià)比較結(jié)果表明，濁度法測定乙酰麥迪霉素制劑效價(jià)的方法準(zhǔn)確、可靠、快捷，并具有更低的檢測限、更直觀的效果。本方法作為乙酰麥迪霉素制劑效價(jià)測定的質(zhì)控方法值得推廣，可與管碟法并存。

[1]WS1-（X-352）-2003Z，乙酰麥迪霉素[S].2004.

[2]WS1-（X-320）-2003Z，乙酰麥迪霉素片[S].2004.

[3]WS1-（X-254）-2003Z，乙酰麥迪霉素干混懸劑[S].2004.

[4]王金龍，高燕霞.濁度法測定四環(huán)素的效價(jià)[J].藥物分析雜志，2007，27（12）:1 988.

[5]高燕霞，王茉莉.交沙霉素及其片劑效價(jià)的比濁法測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2008，39（2）:123.

[6]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄93、附錄95.

[7]羅 旭.化學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社，2001:120-121.