王曉青，劉揚(yáng)，陳袁蘭，朱愛(ài)軍，張光宇，張學(xué)農(nóng)#，任偉新，迪理木拉提·巴吾東，顧俊鵬，許曉東（.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇蘇州 53；.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，烏魯木齊 830054）

阿苯達(dá)唑（Albendazole，ABZ）為苯并咪唑類(lèi)廣譜抗寄生蟲(chóng)藥，是治療泡球蚴病和細(xì)粒棘球蚴病的首選藥物之一，研究[1，2]證明，由于ABZ的低溶解性和在體內(nèi)廣泛的分布性，極大影響了其吸收及生物利用度，且療效與其溶解性呈正相關(guān)，因此，提高ABZ溶解度和口服生物利用度或研究其新型肝動(dòng)脈栓塞微球制劑是目前治療包蟲(chóng)病的有效途徑。

固體分散體是提高難溶性藥物溶解度和生物利用度的有效途徑，且工藝簡(jiǎn)單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)[3，4]。本課題以親水性材料聚乙二醇6000（PEG）為載體，采用了固體分散技術(shù)制備ABZ固體分散體（ABZ-SD，ASD）。同時(shí)，利用殼聚糖（Chitosan，CS）為天然的陽(yáng)離子聚合物，具有無(wú)毒、生物相容性好、體內(nèi)降解產(chǎn)物易被人體吸收、毒副作用小的特點(diǎn)[5]。以ASD為主體、殼聚糖為載體材料，采用乳化交聯(lián)法制備殼聚糖骨架型微球，以達(dá)到提高ABZ生物利用度、穩(wěn)定性和延長(zhǎng)其體內(nèi)作用時(shí)間的目的。

1 儀器與試藥

UV2401-PC型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；ME215S型分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；pHS-3TC型數(shù)顯pH計(jì)（上海天達(dá)儀器有限公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；S-4700冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（日本日立公司）；Mercury CCD X射線單晶衍射儀（日本理學(xué)電機(jī)株式會(huì)社）；DSC 2010熱分析儀（美國(guó)TA Instruments公司）。

ABZ（武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司，批號(hào):090901，純度:99.16%）；殼聚糖（浙江澳興生物科技有限公司，分子量Mw:50 kDa，脫乙酰度:93%）；ASD（蘇州大學(xué)自制，載藥量:20%）；PEG、司盤(pán)（Span）-80、液體石蠟、25%戊二醛、甲醇（色譜純）均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；其余試劑均為分析純。

2 ASD的制備及鑒別、表征

2.1 制備方法

取PEG油浴80℃熔融，于攪拌狀態(tài)加入ABZ，使藥物均勻分散在熔融的載體（PEG）后傾倒于預(yù)冷4℃玻璃板上冷卻固化。－18℃冷凍20 min后干燥24 h，粉碎過(guò)230目分樣篩備用。

2.2 平衡溶解度的測(cè)定[6]

分別取ABZ、ABZ與不同比例PEG（藥載比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）的固體分散體（ASD1～ASD6），置于蒸餾水中，35℃恒溫振搖3 d，至其溶解度不變?yōu)橹?；靜置，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，紫外295 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度并計(jì)算其溶解度。結(jié)果，隨著載體比例的增加，ASD的溶解度呈增加趨勢(shì)，當(dāng)藥載比為1∶6時(shí)（ASD6），其溶解度達(dá)到原藥溶解度的31.09倍，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 溶解度試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of solubility experiment（n＝3）

取上述ASD同批次制備微球，分別測(cè)定其包封率和載藥量，結(jié)果顯示藥物在微球中的包封率和載藥量并不是隨著載體比例的增加而增加，當(dāng)藥載比為1∶4時(shí)，其包封率和載藥量最高。推測(cè)原因可能是載體比例過(guò)大，藥物的溶解度顯著增加的同時(shí)易通過(guò)油水界面擴(kuò)散至水相[7]，導(dǎo)致其包封率降低，故最終ASD的藥載比確定為1∶4。

2.3 ASD的鑒別與表征

2.3.1 掃描電鏡觀察。取適量ABZ及ASD（1∶4），用導(dǎo)電膠帶粘結(jié)固定后濺金，并固定在樣品臺(tái)上，對(duì)準(zhǔn)架臺(tái)的槽溝送入到停止點(diǎn)為止，然后抽真空觀察粉末形態(tài)。二者掃描電鏡照片見(jiàn)圖1。

由圖1可知，ABZ呈砂晶分布，而ASD呈無(wú)定形存在，表明藥物由于晶型的改變而使其溶解度增大。

2.3.2 紅外光譜。分別取ABZ、ABZ與PEG物理混合物、ASD、PEG，在波數(shù)400～4 000 cm－1內(nèi)掃描進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，詳見(jiàn)圖2。

由圖2顯示，ASD與物理混合物在指紋區(qū)和其他區(qū)域均基本相似，說(shuō)明ABZ的化學(xué)結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，且ASD的紅外光譜只是ABZ與PEG光譜的簡(jiǎn)單疊加，表明藥物與載體之間并未發(fā)生氫鍵效應(yīng)等作用，ASD中無(wú)新的復(fù)合物產(chǎn)生。

圖1 掃描電鏡圖Fig 1 TEM

圖2 固體分散體紅外光譜圖Fig 2 FT-IR spectra of solid dispersions

3 ABZ含量測(cè)定方法的建立[8]

精密稱(chēng)取ABZ 10 mg置于25 mL量瓶中，加冰醋酸1 mL，溶解后加甲醇至刻度作為儲(chǔ)備液；分別精密量取儲(chǔ)備液0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到不同濃度的一系列溶液，搖勻；在295 nm波長(zhǎng)下測(cè)定，以吸光度（A）和濃度（c）進(jìn)行回歸，得其線性方程為:c＝0.040 6A+0.017（r＝0.999 4），ABZ檢測(cè)濃度線性范圍為1～20 μg·mL－1。按相關(guān)方法進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)，結(jié)果，低、中、高濃度回收率分別為101.3%、100.4%、99.42%，平均回收率為100.37%（RSD＝0.94%）；平均日內(nèi)RSD＝0.21%，日間RSD＝0.88%。

首先，推進(jìn)利率市場(chǎng)化。銀行業(yè)高利潤(rùn)為有序推進(jìn)利率市場(chǎng)化創(chuàng)造了良好機(jī)遇。當(dāng)前，應(yīng)鼓勵(lì)銀行多向中小企業(yè)提供融資服務(wù)，完善銀行貸款利率的風(fēng)險(xiǎn)定價(jià)機(jī)制，以實(shí)現(xiàn)我國(guó)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和收入分配結(jié)構(gòu)的不斷優(yōu)化。

4 ABZ-PEG殼聚糖微球的制備與藥劑學(xué)性質(zhì)評(píng)價(jià)

4.1 微球的制備

取ASD緩慢加入已溶脹好的殼聚糖溶液超聲溶解即得水相，將水相逐滴（1滴/2 s）加入至含乳化劑Span-80的液體石蠟中，恒速乳化后加戊二醛交聯(lián)固化2 h，石油醚、異丙醇清洗，40℃干燥15 h，即得ABZ-PEG殼聚糖微球；不加ASD即得空白殼聚糖微球。

4.2 包封率和載藥量的測(cè)定

取研細(xì)的微球加冰醋酸消解，甲醇定容至50 mL，搖勻，295 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，由下面公式計(jì)算載藥量和包封率:載藥量＝（微球中ABZ的重量/微球重量）×100%；包封率＝（微球中ABZ的重量/ABZ投藥量）×100%。

4.3 微球制備工藝優(yōu)化

結(jié)合文獻(xiàn)[9]以及單因素考察試驗(yàn)結(jié)果，選定對(duì)微球包封率、載藥量、粒徑分布和產(chǎn)率影響較大的Span-80含量（A）、殼聚糖濃度（B）以及油-水（液體石蠟-含藥殼聚糖溶液）比例（C）為影響因素，設(shè)定處方總量為70 mL，加入藥物量為140 mg，采用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，以a（平均粒徑，μm）、b（產(chǎn)率，產(chǎn)率＝干燥后微球總量/（ABZ投藥量+殼聚糖量）×100%，%）、c（包封率，%）、d（載藥量，%）為指標(biāo)，分別給4個(gè)指標(biāo)賦予－0.3、－0.1、0.3、0.3的權(quán)重，采用綜合加權(quán)評(píng)分法進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。粒徑評(píng)分＝－0.3×a/目標(biāo)粒徑；產(chǎn)率評(píng)分＝－0.1×b/最大產(chǎn)率；包封率評(píng)分＝0.3×c/最高包封率；載藥量評(píng)分＝0.3×d/最大載藥量。故綜合評(píng)分＝粒徑評(píng)分+產(chǎn)率評(píng)分+包封率評(píng)分+載藥量評(píng)分＝－0.3×a/200－0.1×b/91.12+0.3×c/67.19+0.3×d/6.91。因素水平見(jiàn)表2，正交結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表2 因素水平表Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of orthogonal design

表4 方差分析表Tab 4 Analysis of variance

由直觀分析結(jié)果判斷，3因素極差大小依次為A＞B＞C，再綜合方差分析，其中Span-80的用量和殼聚糖濃度對(duì)綜合評(píng)分有顯著性影響（P＜0.05），因此，3因素的最佳組合為A3B3C2。最終確定的較佳處方工藝為Span-80的含量:0.015 g·mL－1，殼聚糖濃度:2.2%，油-水比例:10∶1。

4.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用較優(yōu)工藝處方制備微球，重復(fù)5次，同等條件測(cè)定上述指標(biāo)。結(jié)果，包封率為（57.86±0.74）%（RSD＝1.27%），載藥量為（6.42±0.32）%（RSD＝1.87%），粒徑為（210±3.8）μm（RSD＝1.8%），產(chǎn)率為（85.77±1.5）%（RSD＝1.74%）。結(jié)果表明，較優(yōu)工藝處方制備微球達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)，且工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好。

4.5 微球的藥劑學(xué)性質(zhì)評(píng)價(jià)

4.5.1 形態(tài)粒徑考察。取微球適量均勻撒布在載玻片上以計(jì)數(shù)法測(cè)定其平均粒徑，用電鏡觀察（30倍）微球的表面形態(tài)及特征，見(jiàn)圖3A；另取制備后微球及放置2個(gè)月后的微球，用掃描電鏡放大300倍觀察微球表面形態(tài)，詳見(jiàn)圖3B、圖3C。

圖3結(jié)果表明，微球形態(tài)圓整，粒徑分布均勻，平均粒徑約210 μm，表面光滑、圓整，互不粘連，分散性好。

圖3 微球形態(tài)電鏡圖Fig 3 Appearance of MS under electric microscope

4.5.2 粉體學(xué)性質(zhì)考察。取10 g微球，分別進(jìn)行圓整度、壓縮度及休止角等粉體學(xué)性質(zhì)的考察。（1）圓整度:取定量微球置于平板上，將平板一側(cè)抬起，測(cè)量微球滾動(dòng)前傾斜平面與水平面的夾角。（2）壓縮度:取定量微球輕裝入量筒中測(cè)量最初疏松體積；在桌面上輕敲至體積不再減小為止，測(cè)量最終體積；計(jì)算最松密度ρ0和最緊密度ρf，計(jì)算壓縮度C＝（ρf－ρ0）/ρf×100%。（3）休止角:測(cè)量漏斗的高度和形成圓錐體的半徑，計(jì)算休止角。3批樣品結(jié)果詳見(jiàn)表5。

表5 微球粉體學(xué)性質(zhì)考察Tab 5 Micromeritics properties of microspheres

表5結(jié)果表明，所制微球分散性和流動(dòng)性均良好。

4.5.3 微球的結(jié)構(gòu)表征。（1）紅外光譜:取ABZ、殼聚糖、物理混合物（ABZ、PEG、殼聚糖）及藥物微球進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 微球紅外光譜圖Fig 4 FT-IR spectra of microspheres

由圖4可見(jiàn)，微球中藥物與PEG的特征峰均消失，說(shuō)明藥物已包載其中。

（2）X衍射分析。取“4.5.3”（1）項(xiàng)下4種樣品進(jìn)行X衍射分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可見(jiàn)，微球中藥物結(jié)晶峰全部消失，而在物理混合物中仍大量存在，證明了藥物已被包埋在殼聚糖微球骨架中，而不是以物理混合物的形式存在。

5 微球的釋放行為

稱(chēng)取微球100 mg置于透析袋中，加4 mL釋放介質(zhì)，用棉繩扎緊封口，固定于螺旋槳上，分別置于（37±0.5）℃、250 mL的0.1 mol·L－1鹽酸、pH 3.5的醋酸鹽溶液、pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）釋放介質(zhì)中，根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》二部附錄ⅩC中小杯法[10]操作，測(cè)定藥物累積釋放率。調(diào)整轉(zhuǎn)速為100 r·min－1，分別于1 、2 、4、6、12 h，1、2、3、4、8、10 d取樣4.0 mL，同時(shí)補(bǔ)充同溫介質(zhì)4.0 mL。樣液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，紫外法測(cè)定其吸光度值，微球在3種介質(zhì)中的釋放情況詳見(jiàn)圖6。

圖5 X衍射分析圖Fig 5 X-ray diffraction

圖6 微球在3種介質(zhì)中的體外釋放曲線Fig 6 Release profiles of microspheres in 3 kinds of medium in vitro

圖7 3種樣品在pH3.5醋酸鹽溶液中的體外釋放曲線Fig 7 Release profiles of 3 samples in pH3.5 acetate so lution

由圖6可見(jiàn)，微球在pH3.5醋酸鹽溶液中釋放更優(yōu)，微球前30 min內(nèi)，釋放率低于40%，基本不產(chǎn)生突釋現(xiàn)象；同時(shí)總體釋放程度顯著提高，顯示出其顯著緩釋效果。故選其作為微球的釋放介質(zhì)，同時(shí)以ABZ、ASD作為對(duì)照。由于固體分散體使原料藥溶出度得到大幅度改善，故延長(zhǎng)各樣品釋放時(shí)間至17 d（408 h）。3種樣品體外釋放詳見(jiàn)圖7。

將ABZ、ASD及微球釋放時(shí)間（t）與藥物的累積釋放率（Q）分別用一級(jí)釋放模型、威布爾（Weibull）函數(shù)、Higuchi方程進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 3種樣品釋放曲線擬合方程Tab 6 Regression equations for drug release of 3 samples in vitro

以各方程的相關(guān)系數(shù)為指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASD和微球在介質(zhì)中的釋放行為按Higuchi方程擬合效果較好，且Higuchi系數(shù)分別為0.021 6、0.026 4，表明微球的釋放模式符合殼聚糖微球的孔道擴(kuò)散機(jī)制。同時(shí)釋放曲線和擬合方程均顯示所制備微球有顯著的緩釋效果。

6 討論

ABZ水溶性極差，但易溶于冰醋酸，而殼聚糖易溶于稀酸溶液，將ABZ制備為親水性材料固體分散體后，水溶性顯著提高，降低了其對(duì)高濃度醋酸的依賴(lài)性，進(jìn)而可均勻分散在殼聚糖的稀酸溶液中，為微球的制備提供了可能性；殼聚糖體內(nèi)降解產(chǎn)物易被人體吸收，毒副作用小，在緩釋給藥系統(tǒng)中應(yīng)用非常廣泛。

以平均粒徑、產(chǎn)率、包封率和載藥量為指標(biāo)篩選處方和制備工藝，結(jié)果表明轉(zhuǎn)速是影響微球粒徑大小及分布的主要因素，隨著轉(zhuǎn)速增大，微球的平均粒徑逐漸減小，當(dāng)轉(zhuǎn)速低于500 r·min－1，平均粒徑增大且分布不均。經(jīng)過(guò)反復(fù)調(diào)整，最終確定以750 r·min－1的轉(zhuǎn)速進(jìn)行處方優(yōu)化。同時(shí)，ASD的粉碎程度直接影響微球的圓整度，當(dāng)ASD粉末不能過(guò)200目分樣篩時(shí)，所制微球表面突起不平，不利于栓塞給藥。

ASD能顯著提高藥物的溶解度，其原因主要是載體材料PEG可有效抑制藥物結(jié)晶，使其成為無(wú)定形高分散的狀態(tài)；固體分散體具有較大的表面積，隨著可溶性載體的降解，藥物可在骨架中緩慢釋放。同時(shí)釋放曲線顯示，ASD溶出速率明顯快于ABZ。本法制備的微球吸附藥物較少，前期釋放的藥物主要是處于微球孔道內(nèi)的藥物，殼聚糖溶脹使得微孔口徑減小甚至通道關(guān)閉，隨后的藥物釋放通過(guò)骨架慢慢地?cái)U(kuò)散或通過(guò)殼聚糖的降解慢慢地釋放。由釋放曲線可知，通過(guò)乳化交聯(lián)法制成的ASD殼聚糖微球具有良好的緩釋性能。

固體分散體同時(shí)面臨著貯放時(shí)間長(zhǎng)后易老化的缺點(diǎn)，這是因?yàn)槠渲械乃幬镂锢斫Y(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，成為無(wú)定形而存在，有轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的藥物結(jié)晶的趨勢(shì)。這可通過(guò)添加表面活性劑、多元載體等方法改進(jìn)工藝等解決，本試驗(yàn)將制得的固體分散體在短期內(nèi)制備成微球可以有效地防止其老化。經(jīng)過(guò)優(yōu)化工藝制備的微球表面光滑、球形圓整。通過(guò)篩選分級(jí)后得到不同粒徑段的微球，可滿足體內(nèi)各大、中、小血管栓塞的要求。

[1]王建華，溫 浩，孫殿甲.阿苯達(dá)唑的體內(nèi)過(guò)程和劑型研究進(jìn)展[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)病防治雜志，2002，15（3）:187.

[2]Venkatesan P.Albendazole[J].J Antimicrob Chemother，1998，41（2）:145.

[3]張 波，張東娜，王洪權(quán)，等.難溶性藥物增溶技術(shù)的研究進(jìn)展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（5）:425.

[4]杜光玲，趙燕燕，劉會(huì)芳，等.洛伐他汀固體分散體的制備和體外溶出度[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2008，39（8）:598.

[5]Lim ST，Mrtin GP，Berry DJ，et al.Preparation and evaluation of the in vitro drug release properties and mucoadhesion of novel microspheres of hyaluronic acid and chitosan[J].J Control Release，2000，66（5）:281.

[6]徐曉弘，翟所迪.阿苯達(dá)唑固體分散物制備及體外溶出特性研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2002，37（4）:283.

[7]O’Donnell PB，McGinity JW.Preparation of microspheres by the solvent evaporation technique[J].Adv Drug Deliv Rev，1997，28（1）:25.

[8]張學(xué)農(nóng)，張 強(qiáng)，溫 浩，等.乳化聚合法制備阿苯達(dá)唑聚氰基丙烯酸酯納米球的方法比較及穩(wěn)定性考察[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2003，38（5）:357.

[9]劉 純，金夢(mèng)瑤，張學(xué)農(nóng)，等.絲素蛋白-殼聚糖雙氯芬酸鈉緩釋微球的制備與特性研究[J].中國(guó)新藥雜志，2009，18（16）:1 566.

[10]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅩC.