李啟虎 王學(xué)華

1.四川省長寧縣中醫(yī)院，四川長寧 644300；2.四川省宜賓市第一人民醫(yī)院泌尿外科，四川宜賓 644000

近年來，我國泌尿科臨床最常見的腫瘤是膀胱腫瘤。其中，有約90%的膀胱惡行腫瘤是膀胱移行細(xì)胞癌[1]。國內(nèi)外近期的研究證實(shí)供應(yīng)腫瘤的營養(yǎng)物質(zhì)依賴于腫瘤血管，影響腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。近年來研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)主要圍繞和側(cè)重于腫瘤血管的形成機(jī)制及抗腫瘤血管形成兩方面[2-3]。

本實(shí)驗(yàn)通過探討血管生成素-2（Ang-2）和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)、臨床分期之間表達(dá)和相互關(guān)系，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，探討兩者在膀胱移行細(xì)胞癌中表達(dá)的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取經(jīng)60例膀胱移行細(xì)胞癌患者，均經(jīng)臨床病理診斷確診，男51例，女9例，年齡33～81歲，平均（60.1±3.6）歲。所有試驗(yàn)樣本均經(jīng)過手術(shù)切除，石蠟包埋細(xì)胞癌標(biāo)本并存檔。其中，進(jìn)行尿道膀胱腫瘤電切33例，膀胱部分切除17例，根治性全膀胱切除10例。20例患者取前列腺摘除術(shù)切除的多余正常膀胱黏膜。對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本編號(hào)并做連續(xù)切片，每個(gè)樣本切片厚度4 cm，每個(gè)樣品切5片，一張用作HE染色，一張用作陰性對(duì)照，兩張用于Ang-2和HIF-1α的檢測(cè)，剩余一張備用。各實(shí)驗(yàn)樣本切片經(jīng)常規(guī)常規(guī)HE染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察。病理分級(jí)根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分為三級(jí)，Ⅰ級(jí)21例，Ⅱ級(jí)22例，Ⅲ級(jí)17例；臨床分期按UICC分期標(biāo)準(zhǔn)[4]，淺表型（Tis-T1期）43例，Ta 5例，T1 38例；17例浸潤型（T2-T4期），T2 11例，T3 5例，T4 1例。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟與試劑

將石蠟切片脫蠟至水，按照試劑盒說明書采用免疫組化染色S-P法測(cè)定，Ang-2和 HIF-1α一抗工作濃度均為1∶100，最后脫水，透明，中性樹膠封固，顯微鏡觀察。Ang-2陽性結(jié)果顯微觀察中，400倍的高倍鏡下選擇4個(gè)強(qiáng)免疫反應(yīng)視野觀察并計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)量≥800個(gè)。HIF-1α陽性結(jié)果顯微觀察中，高倍鏡下隨機(jī)抽取5個(gè)視野對(duì)腫瘤細(xì)胞觀察，并計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)量200個(gè)。

一抗：Ang-2（武漢博士德生物工程有限公司，BA1530）；HIF-1α多克隆兔抗人抗體（武漢博士德生物工程有限公司，BA0912）；即用型超敏S-P試劑盒（鼠兔通用型）（福州邁新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，KIT-9710），DAB（福州邁新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，DAB-0031）；檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（福州邁新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，MVS-0066）。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 Ang-2陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞漿和胞膜中分布著以棕黃色顆粒狀或線網(wǎng)狀為主的Ang-2陽性染色體，結(jié)果判斷參照文獻(xiàn)[4]。根據(jù)細(xì)胞的染色程度和比率將計(jì)數(shù)細(xì)胞分為4個(gè)級(jí)別：無陽性細(xì)胞為陰性（-）；20%陽性細(xì)胞并微弱染色為弱陽性（+）；20%～50%陽性細(xì)胞并中度染色為中度陽性（++）；＞50%陽性細(xì)胞并強(qiáng)染色為強(qiáng)陽性（+++）。陽性表達(dá)判定：中度陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++），陰性表達(dá)判定：陰性（-）和弱陽性（+）。見圖1。

1.3.2 HIF-1α陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞核和（或）胞漿中分布著以棕黃色顆粒狀為主的HIF-1α陽性染色體。結(jié)果判斷參照文獻(xiàn)[5]。按細(xì)胞染色強(qiáng)度和比率分為5個(gè)級(jí)別：（-）腫瘤細(xì)胞無著色；（±）＜10%的細(xì)胞染色；（+）11%～25%的細(xì)胞染色；（++）26%～50%的細(xì)胞染色；（+++）51%的細(xì)胞染色。陽性表達(dá)判定：中度陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++），陰性表達(dá)判定：陰性（-）和弱陽性（+）。見圖2。

圖1 TCCⅡ級(jí)組織中Ang-2（+），陽性物質(zhì)位于腫瘤細(xì)胞胞漿胞膜，呈棕黃色（SP×400）

圖2 TCCⅡ級(jí)組織中HIF-1α（+），陽性物質(zhì)主要位于腫瘤細(xì)胞核，呈棕黃色（SP×400）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析,計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)和Spear-man等級(jí)相關(guān)分析檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ang-2陽性表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)的關(guān)系

本研究中Ang-2和HIF-1α在正常膀胱組織中無表達(dá)，但在膀胱移行細(xì)胞癌標(biāo)本均有表達(dá)，Ang-2和HIF-1α在膀胱移行細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率分別為47.7%（28/60）、41.7%（25/60）。Ang-2和HIF-1α在膀胱移行細(xì)胞癌中陽性表達(dá)率隨其病理分級(jí)和臨床分期增加而升高。見表1。

表1 Ang-2陽性表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)的關(guān)系

2.2 Ang-2陽性表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌臨床分期的關(guān)系

Ang-2陽性表達(dá)率和染色強(qiáng)度與臨床分期成正比關(guān)系，各期的陽性率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)x2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001＜0.05）。見表2。

表2 Ang-2陽性表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌臨床分期的關(guān)系

2.3 HIF-1α陽性表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)的關(guān)系

HIF-1α陽性率在膀胱移行細(xì)胞癌陽性率逐步升高，表明HIF-1α陽性表達(dá)率和染色強(qiáng)度與病理分級(jí)成正比關(guān)系。見表3。

2.4 HIF-1α陽性表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌臨床分期的關(guān)系

試驗(yàn)中Tis-T1期與T2-T4期的陽性率分別為23.3%、73.7%，兩期的陽性率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)x2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001＜0.05），HIF-1α陽性率越高膀胱移行細(xì)胞癌的浸潤越深。見表4。

表3 HIF-1α陽性表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)的關(guān)系

表4 HIF-1α陽性表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌臨床分期的關(guān)系

2.5 Ang-2、HIF-1α在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)情況

經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，Ang-2與HIF-1α的等級(jí)相關(guān)系數(shù)rs為0.498，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

表5 Ang-2、HIF-1α在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)情況

3 討論

有研究認(rèn)為，正常的膀胱組織中血管穩(wěn)定，呈靜息狀態(tài)，而腫瘤血管的形成受膀胱移行細(xì)胞癌的腫瘤血管不穩(wěn)定的誘導(dǎo)，而這種不穩(wěn)定與Ang-2有關(guān)[5]，通過抑制Ang-1與Tie2結(jié)合使得自身可以與Tie2受體結(jié)合。膀胱移行細(xì)胞癌浸潤的深淺度與Ang-2陽性率有關(guān)，陽性率越高浸潤越深，表示預(yù)后越差，這點(diǎn)在本次通過研究中被證實(shí)，Ang-2陽性率在膀胱移行細(xì)胞癌G1、G2、G3級(jí)中分別為28.6%、54.5%、64.7%，陽性率逐步升高，表明Ang-2陽性表達(dá)率和染色強(qiáng)度與病理分級(jí)成正比關(guān)系，Tis-T1期與T2-T4期的陽性率分別為32.6%、82.4%，兩期的陽性率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)x2檢驗(yàn)， P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），表明陽性率越高膀胱移行細(xì)胞癌的浸潤越深。Ang-2參與膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程，可能通過調(diào)節(jié)腫瘤血管形成來完成。癌變過程中膀胱組織獲得了Ang-2，試驗(yàn)中強(qiáng)陽性染色多分布在高分級(jí)（G3）和高分期（≥T2）腫瘤的癌細(xì)胞中，另外部分切片可在腫瘤微血管內(nèi)皮上發(fā)現(xiàn)有陽性表達(dá)。

有研究表明，HIF-1α在膀胱移行細(xì)胞癌中過表達(dá)可上調(diào)VEGF,日本研究表明，有學(xué)者通過建立HIF-1α過表達(dá)膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株（EJ-HIF1[alpha] cells）并對(duì)其研究后發(fā)現(xiàn)，過HIF-1α的過表達(dá)加速細(xì)胞增殖生長[6-7]。HIF-1α過表達(dá)參與膀胱移行細(xì)胞癌血管的形成[8-9]，Kondo等[9]研究表明，HIF-1α陽性率與膀胱腫瘤組織中微血管計(jì)數(shù)（microvessel count，MVC）正相關(guān)。本研究通過對(duì)HIF-1α與膀胱移行細(xì)胞癌臨床病理特征兩者之間關(guān)系進(jìn)行分析，HIF-1α過表達(dá)可能通過提高腫瘤血管形成而促進(jìn)膀胱移行細(xì)胞癌的生長，HIF-1α陽性率在膀胱移行細(xì)胞癌G1、G2、 G3級(jí)中分別為23.8%、40.9%、64.7%，陽性率逐步升高，表明HIF-1α陽性表達(dá)率和染色強(qiáng)度與病理分級(jí)成正比關(guān)系，本研究中G1與G3陽性率相比較，經(jīng)x2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.016＜0.05）也證實(shí)這一結(jié)論。試驗(yàn)中Tis-T1期與T2-T4期的陽性率分別為23.3%、73.7%，兩期的陽性率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)x2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001＜0.05），HIF-1α陽性率越高膀胱移行細(xì)胞癌的浸潤越深。本研究結(jié)果表明，膀胱移行細(xì)胞癌的惡性程度及浸潤程度與HIF-1α有關(guān)，其陽性表達(dá)率、染色強(qiáng)度與病理分級(jí)和臨床分期成比例關(guān)系。在整個(gè)癌變過程中膀胱組織有基因突變發(fā)生，還發(fā)現(xiàn)在腫瘤血管上皮細(xì)胞核上有許多標(biāo)本切片中的HIF-1α呈現(xiàn)強(qiáng)染色并參與膀胱移行細(xì)胞癌的缺氧調(diào)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)通過探討血管生成素-2和缺氧誘導(dǎo)因子-1α在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)、臨床分期之間表達(dá)和相互關(guān)系，有研究認(rèn)為Ang-2和 HIF-1α的陽性率表達(dá)之間有正向相關(guān)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，Ang-2和HIF-1α在膀胱移行細(xì)胞癌中表達(dá)，rs（Ang-2，HIF-1α）=0.498，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其在缺氧這一始動(dòng)因素作用下相互協(xié)同調(diào)節(jié)VEGF并相互影響，且呈現(xiàn)兩兩相關(guān)的特殊關(guān)系，共同參與膀胱移行細(xì)胞癌的腫瘤血管形成，進(jìn)而影響膀胱移行細(xì)胞癌的生物學(xué)行為。目前尚不清楚其具體作用機(jī)制，需要科學(xué)工作者及臨床醫(yī)務(wù)者們共同繼續(xù)研究。

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