寇彥杰，華君，秦嶺

（成都華高藥業(yè)有限公司，四川成都610041）

天然甜味劑甜菊糖甙的質量標準研究

寇彥杰，華君，秦嶺

（成都華高藥業(yè)有限公司，四川成都610041）

對比研究當前國內和國際上天然甜味劑甜菊糖甙的質量標準，并將各標準的含量測定方法進行對比試驗，探討適用于以甜葉菊干葉為原料，經提取、精制而得各種規(guī)格甜菊糖甙產品的質量標準。

甜菊糖甙；天然甜味劑；質量標準

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertohi），為菊科（Composital）斯臺比亞屬（Stevia），多年生草本植物。甜菊糖甙（steviol glycosides）是從甜葉菊的葉和莖中提取出來的高甜度、低熱量天然甜味劑，它主要含9種[2-4]不同甜味成分：甜菊甙（Stevioside），瑞鮑迪甙（Rebaudioside A、B、C、D、F），杜克甙（Dulcoside A），甜茶甙（Rubusoside）和甜菊雙糖甙（Steviolbioside）。目前與天然甜味劑甜菊糖甙產品相關的質量標準有：國家質量技術監(jiān)督局批準的中華人民共和國國家標準GB 8270-1999食品添加劑甜菊糖甙[1]，以下簡稱GB8270-1999；糧農組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives）發(fā)布的Steviol Glycosides[2]，以下簡稱JECFA 2010；美國《食品化學法典》（Food Chemicals Codex）發(fā)布的Rebaudioside A[3]，以下簡稱FCC 2009。隨著甜菊糖甙提取、分離純化生產工藝技術水平的提高，實踐中發(fā)現(xiàn)上述單個標準已經不能滿足目前甜菊糖甙產品的質量控制要求。因此，對比研究上述3個質量標準，探討適用于以甜葉菊干葉為原料，經提取、精制而得的各種規(guī)格甜菊糖甙產品的質量標準，為甜菊糖甙產品的生產和質量控制提供參考。

表1 GB 8270-1999食品添加劑甜菊糖甙理化指標

表2 JECFA 2010 Steviol Glycosides理化指標

表3 FCC 2009 Rebaudioside A理化指標

1 甜菊糖甙質量標準簡介

1.1 我國國家標準GB 8270-1999食品添加劑甜菊糖甙

外觀：白色、微黃色松散粉末或晶體。理化指標見表1。

1.2 JECFA 2010 Steviol G lycosides標準

外觀：白色、淺黃色粉末，有輕微特有的氣味或無味。理化指標見表2。

1.3 FCC 2009 Rebaudioside A標準

外觀：白色、類白色精細晶體，顆?；蚍勰?，具有吸濕性，甜味。理化指標見表3。

1.4 質量標準的主要差異對比

對比上述3個質量標準發(fā)現(xiàn)存在的主要差異見表4。

2 甜菊糖甙質量標準含量測定的研究

2.1 儀器和試藥試劑

Agilent1200高效液相色譜儀（配備在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器）；CP225D型電子分析天平（Sartorius公司）；DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱；PHS-25C型pH酸度計；KQ-250B型超聲波清洗器。對照品Stevioside（99.2%）和Rebaudioside A（98.3%）購自日本和光株式會社（Wako Pure Chemical Industries，Ltd）以下簡稱Wako；Stevioside（98.6%）和Rebaudioside A（96.2%）購自美國ChromaDex公司，以下簡稱ChromaDex；Stevioside（98.4%）和Rebaudioside A（98.3%）購自美國藥典（U.S.Pharmacopeia）以下簡稱USP；甜菊糖甙樣品（含量95%、90%、85%、80%、Rebaudioside A≥97%和Stevioside≥90%等規(guī)格）由成都華高藥業(yè)有限公司提供。乙腈為色譜純，購自美國Fisher公司；其它試劑均為國產分析純；水為重蒸鎦水。

2.2 高效液相色譜條件

2.2.1 GB 8270-1999標準色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX NH24.6mm×250 mm 5μm；流動相：乙腈-水（80∶20）；流速：1.2mL/min；檢測波長：210 nm；進樣量：15μL。按標準規(guī)定方法對各規(guī)格甜菊糖甙進行檢測并記錄色譜圖，見圖1。

表4 3種質量標準差異的對比

圖1 GB 8270-1999標準stevioside對照品、rebaudioside A對照品和甜菊糖甙樣品高效液相色譜圖

2.2.2 JECFA 2010標準色譜條件色譜柱：Phenomenex C184.6mm×250 mm 5μm；流動相：乙腈-10mmol/L磷酸鹽緩沖溶液pH 2.6（32∶68）；流速：1.0 m L/min；檢測波長：210 nm；柱溫：40℃；進樣量：20μL。按標準規(guī)定方法對各規(guī)格甜菊糖甙進行檢測并記錄色譜圖，見圖2。

圖2 JECFA 2010標準stevioside對照品、rebaudioside A對照品和甜菊糖甙樣品高效液相色譜圖

2.2.3 FCC 2009標準色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX NH24.6mm×150 mm 5μm；流動相：乙腈-pH 4.3醋酸鹽緩沖溶液（80∶20）；流速：1.5mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進樣量：12μL。按標準規(guī)定方法對各規(guī)格甜菊糖甙進行檢測并記錄色譜圖，見圖3。

圖3 FCC 2009 標準stevioside對照品、rebaudioside A對照品和甜菊糖甙樣品高效液相色譜圖

2.3 結果

按上述3個標準方法分別測定不同規(guī)格甜菊糖甙樣品的含量，結果見表5。

表5 標準方法和標準物質

3 討論

3.1 影響甜菊糖甙含量測定結果的主要因素

通過對含量測定方法的對比實驗及對表5試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，影響甜菊糖甙含量測定結果的因素主要有以下幾個方面。

3.1.1 標準物質的選擇FCC 2009標準推薦使用USP的對照品，JECFA 2010標準推薦使用Wako或ChromaDex公司的對照品。對表5數(shù)據(jù)計算，3個公司的Rebaudioside A對照品分別測定樣品1含量結果的相對標準偏差為0.2%，3個公司的Stevioside對照品分別測定樣品2含量結果的相對標準偏差為0.8%，均滿足相對標準偏差不得大于2%的限度要求，因此上述對照品均可作為標準物質使用。

3.1.2 色譜條件的選擇GB 8270-1999和FCC 2009標準的液相色譜法采用-NH2柱。JECFA 2010標準的液相色譜法采用C18柱。通過試驗對比發(fā)現(xiàn)-NH2柱優(yōu)點是分離度高，缺點是重現(xiàn)性差，色譜柱使用壽命短、成本高。C18柱優(yōu)點是重現(xiàn)性好，色譜柱使用壽命長、成本低，分析時間短，缺點是分離度不高。

3.1.3 甜菊糖甙各組分含量的定量方法GB 8270-1999標準的含量測定方法一是液相色譜法，以Stevioside為對照品，標準曲線法（峰面積-濃度曲線）計算甜菊糖甙各組分的含量。JECFA 2010標準的含量測定方法是液相色譜法，以Rebaudioside A為對照品，外標法計算樣品中Rebaudioside A的含量，以Stevioside為對照品，外標法計算樣品中其它甜菊糖甙各組分的含量。FCC 2009標準的含量測定方法是液相色譜法，以Rebaudioside A為對照品，標準曲線法計算樣品中Rebaudioside A的含量，以Stevioside為對照品，標準曲線法計算樣品中其它甜菊糖甙各組分的含量。對表5樣品1含量結果數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，以Stevioside為對照品計算樣品中Rebaudiosdie A的含量比以Rebaudioside A為對照品計算樣品中Rebaudioside A的含量測定結果偏高。通過試驗對比還發(fā)現(xiàn)標準曲線法的優(yōu)點是精密度和準確度高，缺點是操作繁瑣，對照品用量多、成本高。外標法的優(yōu)點是操作簡便，對照品用量少、成本低，缺點是準確度和精密度不高，但能夠滿足要求。

3.1.4 甜菊糖甙含量的計算方法：GB8270-1999標準的甜菊糖甙含量以5個組分（見注1）之和計算，JECFA 2010和FCC 2009標準的甜菊糖甙含量以9個組分（見注2）之和計算，目前已經能夠分離和鑒定甜菊糖甙9個組分[2-4]，所以甜菊糖甙的含量以9個組分的含量之和計算較為科學合理。

綜上所述，GB 8270-1999標準的含量測定方法以液相色譜法作為仲裁法，有值得商榷的內容，例如：以Stevioside為對照品計算樣品中Rebaudioside A組分的含量，甜菊糖甙含量為5個組分（見注1）之和。其含量測定方法二容量法存在操作繁瑣，重現(xiàn)性差等缺點，不能滿足當前甜菊糖甙產品生產質量控制的需要。所以推薦采用JECFA 2010標準的含量測定方法對甜菊糖甙產品在提取、精制生產過程中進行質量控制，其具有操作簡便、色譜系統(tǒng)穩(wěn)定和分析快速準確的優(yōu)點，能夠很好地滿足在線生產質量控制需求。FCC 2009標準的含量測定方法具有精密度和準確度高的優(yōu)點，則適合于高純Rebaudioside A（含量不小于95%）的含量測定。

3.2 國內和國際甜菊糖甙質量標準的發(fā)展趨勢

質量標準不斷發(fā)展的目的是要適應產品發(fā)展的需要，甜菊糖甙工業(yè)已經從第一代產品甜菊糖總甙，第二代產品Stevioside和Rebaudioside A的混合物，發(fā)展到現(xiàn)在的第三代產品高純Rebaudioside A（含量不小于95%）。美國食品和藥物管理局FDA（United States Food and Drug Administration）在2008年12月簽發(fā)了GRAS（Generally Recognized As Safe），確認高純Rebaudioside A（含量不小于95%）可用作一般安全性零卡路里食品甜味劑在普通食品和飲料中按生產需要適量使用。從2008年至今，澳大利亞、新西蘭、法國、瑞士等國家也先后頒發(fā)了Rebaudioside A食用品許可。

目前國內GB 8270-1999標準適應于第一代和第二代甜菊糖甙產品；JECFA 2010標準適應于第一代和第二代甜菊糖甙產品，不完全適用于第三代甜菊糖甙產品；FCC 2009適應于第三代甜菊糖甙產品。3個標準主要在性狀、理化檢測項目和指標限量規(guī)定等存在差異（見表4），在表4中可以對比發(fā)現(xiàn)在理化檢測項目比吸光度、比旋光度、pH、甲醇殘留、乙醇殘留和鉛的測定要求上GB 8270-1999標準和JECFA 2010及FCC 2009標準存在較大差距，因此，為了滿足當前第三代甜菊糖甙產品的質量控制需要，中國國家標準食品添加劑甜菊糖甙GB 8270-1999需要進一步的更新修訂。相信在對甜菊糖甙質量標準不斷深入研究下，國際上能夠達成較為統(tǒng)一的標準，從而促進甜菊糖甙工業(yè)的健康發(fā)展。

[1]GB 8270-1999.中華人民共和國國家標準食品添加劑甜菊糖甙[S].

[2]Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives.Steviol Glycosides[S].published in FAO JECFA，2010，Monographs 10.

[3]Food Ingredients Expert Committee.Rebaudioside A[S].Published in Food Chem icals Codex,2009 6：1438.

[4]Jaroslav Pól，Barbora Hohnovác，Tuulia Hyotylainen.Characterisation of Stevia Rebaudiana by comprehensive two-dimensional

liquid chromatography time-of-flightmass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2007，1150（1-2）：85-92.

[5]BrantC.Hoekstra，Keith A.Chamberlain，James S.Traub，et al.Comparative study of HPLCMethods for the Analysis of Diterpene Glycosides from Stevia rebaudiana[R].57th International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research，2009.

[6]楊揚，陳社云，陳凱，等.甜菊糖提取工藝進展及發(fā)展前景[J].中國食品添加劑，2010（5）：194-199.

[7]楊心偉.芻議國家標準GB 8270-1999的修訂[J/OL].廣州化工，2010（3）：46-48.

Study on Quality Standard of Natural Sweetener Steviol G lycosides

KOU Yan-jie，HUA Jun，QIN Ling
(ChengduWagott Pharmaceutical Co.,Ltd.,Chengdu 610041，China)

The comparative experiment of national and international analytical methods of natural sweetener steviol glycosides was conducted,and suitable specification of quality standard for steviol glycosides products by extracting and refining from the dry leaves of Stevia rebaudiana was explored.

steviol glycosides；natural sweetener；quality standard

S556.9

A

1007-2624（2012）02-0069-04

2011-10-12

寇彥杰，男，工程師，研究方向為天然植物提取物。