吳轉(zhuǎn)娣，劉家勇，陸鑫，張敏，林秀琴，趙培方，吳才文

（云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，開遠616600）

甘蔗近緣屬斑茅組織培養(yǎng)高頻再生體系的建立

吳轉(zhuǎn)娣，劉家勇，陸鑫，張敏，林秀琴，趙培方，吳才文

（云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，開遠616600）

以甘蔗近緣屬植物斑茅的幼嫩葉片為材料，研究MS、SH、B5三種基本培養(yǎng)基和不同激素（2，4-D、NAA、6-BA）配比對斑茅愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)的影響，并篩選出斑茅細胞高頻再生體系的最優(yōu)培養(yǎng)基配方。研究結(jié)果表明，斑茅幼嫩葉片愈傷組織誘導培養(yǎng)基以MS+2，4-D 3.0mg/L+6-BA 0.4mg/L為最適，愈傷組織繼代培養(yǎng)基以MS+2，4-D 3.0mg/L為最適。在此條件下誘導的愈傷組織質(zhì)地疏松，具有較強的分化能力。目的是建立斑茅組織培養(yǎng)的高頻再生體系，為斑茅材料的細胞懸浮培養(yǎng)、染色體加倍和細胞融合等研究提供一定參考。

斑茅；組織培養(yǎng)；高頻再生體系

斑茅（Erianthus arundinaceus）是甘蔗近緣屬植物，染色體為2n=30、40、60，因生勢強、具有抗干旱、抗寒、抗病蟲、耐瘠薄及宿根性強等特點，成為甘蔗育種的重要基因資源，在甘蔗育種中具有較為特殊的育種價值和應用潛力[1-2]，在甘蔗育種研究中倍受關(guān)注，人們希望把斑茅的優(yōu)良性狀基因?qū)敫收嵩耘喾N，改良栽培種的抗逆性、適應性和宿根性。目前利用斑茅雜交已經(jīng)獲得了雜種后代并育成新品種。然而在斑茅雜交的利用過程中，我們發(fā)現(xiàn)其后代的可育性差、真實雜種的鑒定難等一系列問題[3]。隨著基因重組技術(shù)的出現(xiàn)，斑茅抗性基因挖掘和分離、染色體加倍和細胞融合等就成為了利用斑茅培育新品種的新途徑。云南省農(nóng)科院甘蔗研究所依托國家甘蔗種質(zhì)資源圃的資源優(yōu)勢，保存了2000多份甘蔗種質(zhì)資源材料，其中斑茅約200份[4]。而在國內(nèi)還未見有適宜于斑茅的組織培養(yǎng)高頻再生體系的相關(guān)報道。筆者以多份斑茅材料的幼葉為外植體，研究在不同的培養(yǎng)基上誘導斑茅的愈傷組織及繼代培養(yǎng)愈傷組織，進而建立組織培養(yǎng)高頻再生體系，以期為利用愈傷組織或懸浮細胞培養(yǎng)進行細胞加倍或細胞融合等的研究打下一定的基礎(chǔ)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

以云南省農(nóng)科院甘蔗研究所國家甘蔗種質(zhì)資源圃內(nèi)保存的云南83-197、云南95-14、四川79-1-2三份斑茅資源為實驗材料。

1.2 方法

1.2.1 基本培養(yǎng)基的篩選和愈傷組織的誘導取回斑茅的頂端分生區(qū)約50cm長，第一次剝開部分老的葉鞘，保留材料下端（頂芽部分）完整，切除多余的老葉鞘，約25～30cm，以75%乙醇溶液消毒表面，放入超凈工作臺中，剝?nèi)ダ先~鞘，在無菌報紙上切去老的葉鞘剩下10cm長的幼嫩葉鞘，此時能在材料的上端看到兩片葉脈，外表面無毛，離材料下端2～3cm處有一個葉鞘與葉片連接的肥厚帶，即材料已經(jīng)剝到位，將材料切片，置于培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

將外植體分別接種在MS+2，4-D 3.0mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L；SH+2，4-D 3.0mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L；B5+2，4-D 3.0mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L培養(yǎng)基上，觀察不同基本培養(yǎng)基對愈傷組織誘導的影響，選出最優(yōu)基本培養(yǎng)基。

以MS為基本培養(yǎng)基，6-BA、2，4-D、NAA、KT不同梯度濃度進行愈傷組織誘導、愈傷組織繼代和愈傷組織分化培養(yǎng)3種培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度均為30g/L，瓊脂0.4%，pH均為5.8。愈傷組織誘導、愈傷組織繼代均為暗培養(yǎng)，溫度均為25±2℃。分化培養(yǎng)則在光照度為1000～2000lx的光照條件下，25±2℃培養(yǎng)。設(shè)計18種不同激素組合的誘導培養(yǎng)基（見表1），每種組合10皿，每皿接種外植體約16塊（分別來自3個不同的斑茅材料），暗培養(yǎng)15～25d觀察生長情況，全部材料一皿換一皿繼代1次觀察并統(tǒng)計誘導愈傷的情況，分好、較好、中、不好四類統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.2 愈傷組織繼代培養(yǎng)基的篩選選取長勢好的愈傷組織，在以MS+3.0mg/L 2，4-D為基本培養(yǎng)基，添加不同量的NAA、6-BA。繼代培養(yǎng)接種量約為2g/塊，接種約10塊，連續(xù)繼代3次，每次15d繼代1次，15d后取樣稱重，每個處理3次重復，結(jié)果取平均值。

1.2.3愈傷組織的分化培養(yǎng)取連續(xù)繼代3次，質(zhì)地疏松易碎的愈傷組織，接種于MS+KT 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)，觀察苗分化的情況，并記錄。

表1 不同激素組合對斑茅愈傷組織誘導的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對愈傷組織誘導的影響

葉片外植體在3種基本培養(yǎng)基上均能誘導出愈傷組織，以SH培養(yǎng)基啟動最快，培養(yǎng)5d的材料組織膨大，呈淡黃色，褐化材料不多，15d生長較好的葉片外植體周圍長出淡黃色的愈傷組織，生長較差的葉片外植體變黑，約20d繼代1次，愈傷生長加快愈傷生長量增加，愈傷鮮黃繼代后15d統(tǒng)計誘導結(jié)果顯示，在MS基本培養(yǎng)基上誘導率最高，為78%，且出愈傷時間最短，約15d，而B5、SH基本培養(yǎng)基上的誘導率偏低，分別為52%和32%，褐化比較嚴重，出愈傷時間分別在18d和22d。因此我們采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。

2.2 不同激素組合對愈傷組織誘導的影響

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，觀察不同激素組合對斑茅葉片愈傷組織誘導培養(yǎng)的影響（激素組合見表1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以2，4-D 3.0 mg/L誘導效果最好，其中2，4-D 3.0 mg/L+BA 0.4 mg/L的激素組合中愈傷的生長情況最好。

2.3 不同激素對愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

以MS+2，4-D 3.0 mg/L為基本培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)3次，每15d換1次培養(yǎng)基，觀察6-BA和NAA的添加量對斑茅愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響（激素添加情況見表2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與添加了NAA或6-BA的培養(yǎng)基相比，不添加的培養(yǎng)基更加適合于繼代培養(yǎng)。以MS+2，4-D 3.0 mg/L的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)的誘導效果最好，愈傷的生勢好，愈傷質(zhì)地松，呈淡黃色顆粒狀。

2.4 愈傷組織的分化培養(yǎng)情況

將在MS+2，4-D 3.0mg/L培養(yǎng)基中繼代過3次，質(zhì)地疏松易碎的愈傷組織，接種于MS+KT 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)，結(jié)果顯示：愈傷組織的分化能力強，在分化培養(yǎng)過程中沒有出現(xiàn)褐化死亡的現(xiàn)象，具有較強的分化能力。

表2 不同激素對愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

圖1斑茅幼葉愈傷組織培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)及分化培養(yǎng)

3 討論

斑茅是甘蔗育種研究中重要的野生資源，其生物量大，抗性強，是甘蔗品種活力和抗逆性基因源的主要提供者，因此建立斑茅的組織培養(yǎng)高頻再生體系具有重大的研究意義。在對斑茅進行組織培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)斑茅材料在第一次愈傷誘導過程中褐化嚴重，因此本實驗在愈傷誘導時均添加了40mg/L PVP。不同2，4-D濃度對斑茅材料的影響較大，在繼代培養(yǎng)時不宜改變2，4-D的濃度，同時在繼代培養(yǎng)過程中不要繼代多于5次，否則愈傷組織的活力不強，影響后續(xù)的實驗。

[1]程天聰.云南甘蔗種質(zhì)資源考察及有性雜交育種研究[J].西南農(nóng)業(yè)學報，1992，5（1）：14-19.

[2]何順長，楊春輝，肖鳳迥，等.全國甘蔗野生種質(zhì)資源的采集與考察[J].甘蔗，1994（1）：11-17.

[3]鄭雪芳，張木清，李奇?zhèn)?，?甘蔗斑茅的雜交利用及其雜種后代鑒定系列研究（二）：甘蔗斑茅遠緣真實雜種的分子鑒定[J].分子植物育種，2004，2（1）：35-42.

[4]王麗萍，蔡青，范源洪，等.甘蔗（Saccharum）與斑茅（Erianthus arundinaceus）遠緣雜交利用研究[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2007，20（4）：721-726.

[5]Kenia Tiel，Gil A Enriquez，YanaysiCeballo etal.Developmentof a system for rapid plant regeneration from in virtro sugarcane（Saccharum officinarum L.）meristematic tissue[J].Biotecnologia Aplicada，2006，23（1）：22-24.

Establishing High Frequency Regeneration System of Related Genera of Saccharum（Erianthus arundinaceus）

WU Zhuan-di，LIU Jia-yong，LU Xin，ZHANGMin，LIN Xiu-qin，ZHAO Pei-fang，WU Cai-wen
（Yunnan Province Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement /Sugarcane Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kuaiyuan 661600，China）

The young leaves of Erianthus arundinaceus were used to study the effects of basic media and the phytohormone combination（2,4-D、NAA、6-BA）on callus induction as well as subculture of the callus,and to screen out the best cultural formula for high frequency regeneration system of Erianthus arundinaceus.The results showed thatmost suitable medium for callus induction was MSwith 3.0 mg/L 2,4-D and 0.4 mg/L 6-BA.MS with 3.0 mg/L 2,4-D was as the best subculture medium formula，the callus was loose and had stronger differentiation ability under those conditions.The purpose of the experiment was to establish a high frequency regeneration system of Erianthus arundinaceus，and provided a reference for the Erianthus arundinaceus's research，as the cell suspension culture，chromosome doubling and cellular fusion.

Erianthus arundinaceus；tissue culture；high frequency regeneration system

S566.103

A

1007-2624（2012）02-0009-02

2012-01-28

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-20-1-1）。

吳轉(zhuǎn)娣（1982-），女，廣東省江門市人，研究實習員，主要從事甘蔗基因工程育種研究，E-mail：judith1123@126.com。

吳才文，E-mail：gksky_wcw@163.com