余亞圣 黎其友 趙愛春 金筱耘 李曄 余茂德

（西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716）

桑樹是多年生木本植物，抗逆性能較強(qiáng)，即使在極度干旱的沙漠邊緣和冰凌冷寒的北疆地帶都可以見到桑樹[1]。因此，隨著蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，科學(xué)研究的推進(jìn)，桑樹不再只是養(yǎng)蠶的飼料來源，桑樹多元化特別是作為生態(tài)樹種具有廣闊的前景，也是科技工作者關(guān)注的焦點(diǎn)[2]。但是桑樹種質(zhì)資源豐富，品種之間的抗逆性能有顯著差異。研究表明，木本植物在受到水分脅迫時(shí)，可溶性糖和脯氨酸含量有所增加，活性氧自由基積累導(dǎo)致膜脂過氧化，植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受到影響，細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性增加，體內(nèi)氧化物質(zhì)增加，從而會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生過氧化。許多樹種相關(guān)研究顯示，質(zhì)膜透性與細(xì)胞膜過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量的高低與細(xì)胞膜的傷害程度一定程度上呈正相關(guān)關(guān)系[3]，因此，可溶性糖、脯氨酸和丙二醛常常作為鑒定木本植物抗旱性的部分生化指標(biāo)。聚乙二醇（polyethvlene glycol，PEG）是一種高分子滲透調(diào)節(jié)劑，能夠奪取水分對(duì)植物造成滲透脅迫，利用它的滲透調(diào)節(jié)能力處理外植體，提高種子活力及抗逆性是近年來水分脅迫研究的內(nèi)容之一[4－6]。本實(shí)驗(yàn)室桑樹胚軸、子葉離體再生體系已經(jīng)建立，桂優(yōu)62桑樹是商品化的優(yōu)良雜交品種，發(fā)芽早，產(chǎn)葉量高，因此本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)基中添加PEG模擬水分脅迫，測(cè)定組培苗的可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量的變化，桑樹雜交品種的抗水分脅迫能力提供參考，也為篩選桑品種水分脅迫提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

桂優(yōu)62號(hào)桑種（購自廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站）。配制5個(gè)濃度分別為1%、3%、5%、7%、10%PEG溶液。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

種子用雙蒸水預(yù)培養(yǎng)24h，然后用0.1%的升汞消毒2～3min，接著用75%的酒精消毒20 s，最后用雙蒸水沖洗3～5次，在超凈工作臺(tái)上將上述種子分裝到已滅菌的PEG溶液中，并以雙蒸水作為對(duì)照，每瓶100粒種子，最后將4個(gè)培養(yǎng)瓶放入搖床進(jìn)行培養(yǎng)（28℃，100r/min）。將1%、3%、5%、7%、10%的PEG溶液滅菌以后在超凈工作臺(tái)中加入MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，待桑種長(zhǎng)出胚軸后，剝出子葉、胚軸接種。培養(yǎng)條件參照王茜齡等[7]，誘導(dǎo)出的叢生芽備用。

1.3 可溶性糖含量的測(cè)定

采用苯酚法[8]測(cè)定可溶性糖含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線方法略。取叢生芽0.3g，加5mL蒸餾水研磨成勻漿，倒入試管中，用塑料膜封口，于沸水中浸提30min（提取兩次）提取液過濾入25mL容量瓶中，反復(fù)沖洗試管及殘?jiān)?，定容至刻度。吸?.5mL樣品液于試管中（重復(fù)2次），加蒸餾水1.5mL，向試管內(nèi)加入1mL9%苯酚溶液，搖勻，再從管液正面以5～20s加入5mL濃硫酸，搖勻。比色液總體積為8mL，在室溫下放置30min，然后以空白為參比，在485nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出糖的含量。

于485nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以下公式計(jì)算可溶性糖含量：

其中：C—標(biāo)準(zhǔn)曲線得出糖的含量（μg）；VT—提取液體積（mL）；VS—測(cè)定時(shí)取用樣品體積（mL）；N—稀釋倍數(shù)；W—樣品質(zhì)量（g）。

1.4 脯氨酸含量的測(cè)定

采用磺基水楊酸浸提植物脯氨酸，酸性茚三酮顯色處理，于室溫下用二甲苯萃取顯色物質(zhì)，取上清，520nm波長(zhǎng)下比色，利用以下公式計(jì)算脯氨酸含量：

其中：C—標(biāo)準(zhǔn)曲線得出脯氨酸含量（μg）；V—提取液總體積（mL）；a—測(cè)定時(shí)所吸取的體積（mL）；W—樣品質(zhì)量（g）。

1.5 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]的巴比妥酸顯色法，用三氯乙酸提取MDA，2－硫代巴比妥酸顯色，分別于532nm，600nm，450nm處測(cè)定吸光度。利用公式C（μmol/L）＝6.45（A532－A600）－0.56A450消除由蔗糖引起的誤差。其中：A450、A532和A600分別表示450nm、532nm和600nm處的吸光度值。再利用以下公式計(jì)算含量：

2 結(jié)果與分析

2.1 叢生芽的生長(zhǎng)

桑叢生芽在含有不同PEG濃度的MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況有很大的差異（附圖1）。PEG濃度為1%時(shí)，組培苗生長(zhǎng)基本正常；隨著PEG濃度升高，組培苗開始出現(xiàn)黃化葉片；當(dāng)PEG濃度達(dá)到7%時(shí)，可以明顯看出PEG脅迫處理的組培苗比對(duì)照桑苗矮小，大多數(shù)葉片變黃；當(dāng)PEG濃度增加到10%時(shí)，組培苗全部干枯死亡。

2.2 PEG脅迫對(duì)幼苗生理生化指標(biāo)的影響

2.2.1 PEG脅迫對(duì)幼苗可溶性糖含量的影響

（1）可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）樣品中可溶性糖含量的變化

圖2 不同PEG濃度對(duì)叢生芽可溶性糖的影響

由以上圖表可得，在叢生芽的篩選過程中，隨著PEG濃度的增加，可溶性糖含量下降。PEG濃度1%、3%、5%下的可溶性糖含量相當(dāng)，而PEG濃度7%下的含量下降幅度較大，只有對(duì)照組的54.67%。

2.2.2 PEG脅迫對(duì)幼苗脯氨酸含量的影響

（1）脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）樣品中脯氨酸含量的變化

圖4 叢生芽脯氨酸含量變化趨勢(shì)

由以上圖表可得，在苗期篩選的過程中，隨著PEG濃度的增大，脯氨酸含量隨之升高，在PEG濃度5%時(shí)達(dá)到最大值約55ug/g，在7%脯氨酸含量有所下降，但仍比對(duì)照組高。以對(duì)照組脯氨酸含量以指數(shù)100.00計(jì)，（PEG）1%濃度下的含量指數(shù)是其1.2737倍，（PEG）3%濃度下的含量為1.3012倍，而（PEG）5%濃度下的含量則達(dá)到1.9760倍，而（PEG）7%濃度下的含量只有對(duì)照組的1.4326倍。

2.2.3 PEG脅迫對(duì)于幼苗MDA含量的影響

（1）樣品中MDA含量的變化

由上圖可得，在苗期篩選過程中，隨著PEG濃度的增加，丙二醛含量曲折變化，先下降后上升，但各組值均低于對(duì)照組。以對(duì)照組脯氨酸含量以指數(shù)100.00計(jì)，（PEG）1%濃度下的含量指數(shù)是其52.23%，（PEG）3%濃度下的含量則低至其42.94%，而（PEG）5%濃度下的含量為其60.5%，而（PEG）7%濃度下的含量為對(duì)照組的77.96%。

3 討論

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，桑樹組織培養(yǎng)過程添加PEG模擬水分脅迫，桂優(yōu)62桑叢生芽能抵抗的最大濃度為7%。隨著PEG濃度增加，叢生芽的可溶性糖含量增加；隨著PEG濃度的增大，脯氨酸含量隨之升高，這與其它方法鑒定抗水分脅迫的研究結(jié)果一致，但丙二醛含量呈現(xiàn)先下降后上升的曲線變化，并且添加PEG以后，丙二醛含量不同程度下降。相關(guān)研究顯示，細(xì)胞膜過氧化物丙二醛含量的高低與細(xì)胞膜的傷害程度一定程度上呈正相關(guān)關(guān)系，這說明叢生芽受到PEG脅迫后，細(xì)胞膜并沒有受到傷害，推測(cè)可能這些濃度的PEG脅迫還不足以引起細(xì)胞膜的傷害。從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，利用桑樹組織培養(yǎng)能初步分析鑒定桑樹受水分脅迫的部分生化指標(biāo)，脯氨酸對(duì)水分脅迫最敏感，可溶性糖次之。

[1]王軍，馬雙馬，高玉軍，等.淺談桑樹在林業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的優(yōu)勢(shì)[J]，中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2004，20（5）：72－73.

[2]秦儉，何寧佳，黃先智，等.桑樹生態(tài)產(chǎn)業(yè)與蠶絲業(yè)的發(fā)展[J]，蠶業(yè)科學(xué)，2010，36（6）：984－989.

[3]孫憲芝，鄭成淑，王秀峰.木本植物抗旱機(jī)理研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（3）：629－634.

[4]鄭光華，徐本美，顧增輝.PEG引發(fā)種子效果[J].植物學(xué)報(bào)，1985，27（3）：329－333.

[5]Hohl M，Schopfer P.Water relations of growing maize coleptile：Comparison between mannitol and polyethylene glycol6000as external osmotica for a djusting turgor pressure[J].Plant Physiol，1991，95（3）：716－722.

[6]Jackson W T.Use of carbowaxes（polyethylene glycol）as osmotic agents[J].Plant Physiol，1962，37（4）：513－519.

[7]王茜齡，余茂德，徐立，等.桑子葉與胚軸不同區(qū)段離體再生植株的研究[J].蠶業(yè)科學(xué)，2005，31（3）：334－337.

[8]王學(xué)奎.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)（第二版）[M].北京：高等教育出版社，2006：5.

[9]王三根.植物生理生化[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008.

附圖1 叢生芽篩選情況