譚佩毅 黃秀錦

（江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

免疫卵黃抗體球蛋白（yolk immunoglobulin，IgY），又稱雞卵黃抗體，是卵黃中存在的唯一一種免疫球蛋白［1］。它是在特異性抗原刺激作用下由禽類B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生并轉(zhuǎn)移至卵黃中的多克隆抗體。以其性質(zhì)穩(wěn)定、制備簡(jiǎn)單、成本低、產(chǎn)量大、抗體活性高而備受關(guān)注［2］。盡管從卵黃中提取IgY 有諸多優(yōu)點(diǎn)，但在工業(yè)和商業(yè)上的應(yīng)用卻并不廣泛，產(chǎn)量?jī)H占多克隆抗體總產(chǎn)量的2%左右［3］，主要原因在于很難將其從富含脂質(zhì)的卵黃中分離出來［4］。

將IgY 從卵黃中分離出來一般包括分離、提取和純化3個(gè)步驟。分離的關(guān)鍵是如何去除蛋黃中高含量的脂類物質(zhì)［5］，目前主要的分離方法包括水稀釋法、有機(jī)物沉淀法、有機(jī)溶劑抽提法、天然膠法、中鏈脂肪酸法、去污劑分離法、超臨界氣體提取法等［6］。其中水稀釋法工藝比較簡(jiǎn)單，抗體回收率較高，是目前應(yīng)用較廣泛的分離方法［7］。水稀釋法是利用相似相溶原理將水溶性組分溶于水中，而不溶于水的脂蛋白則以沉淀的形式分離出來，加鹽酸調(diào)整pH，可以將不溶性組分完全分離開來。IgY 的提取是將IgY 從水溶性成分中分離出來，得到卵黃抗體，主要用到的沉淀劑有硫酸銨、硫酸鈉、PEG（聚乙二醇）和乙醇等。其中乙醇提取需要－20℃冷凍，硫酸鈉溶解度小，受溫度的影響大，PEG 和硫酸銨兩種方法都比較快速、簡(jiǎn)便［8］。

本試驗(yàn)以水稀釋法為基礎(chǔ)，結(jié)合PEG6000沉淀法對(duì)卵黃中IgY 進(jìn)行分離提取，探討了稀釋倍數(shù)、溶液pH 值、靜置時(shí)間、PEG6000濃度等因素對(duì)IgY 提取率的影響，并通過正交試驗(yàn)對(duì)分離提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在獲得最佳分離條件，為大量制備抗大腸桿菌免疫卵黃抗體奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)蛋海蘭褐蛋雞：25周齡，體重（1 300±100）g，淮安順豐養(yǎng)雞場(chǎng)；

豬源致病性大腸桿菌菌株：江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；

ELISA 試劑盒、羊抗雞HRP－IgG、雞標(biāo)準(zhǔn)IgY、弗氏佐劑（CFA）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；

考馬斯亮藍(lán)G－250：普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；

Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、乙醇、冰醋酸、PEG6000：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)：TU－1900，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

恒溫磁力攪拌器：DX－II，常州諾基儀器有限公司；

恒溫振蕩器：SPH－211F，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

酸度計(jì)：PHS－3C，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

恒溫水浴鍋：HH－601，上海新嘉電子有限公司；

電子精密天平：JA1003A，上海倫捷機(jī)電儀表有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：SCR20BC，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；

酶標(biāo)儀：680，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抗原制備 將豬源致病性大腸桿菌接種于酪蛋白平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24h后，用無菌0.12mol／L 磷酸緩沖液（PBS，pH 為7.2，含0.04mol／L NaCl）洗下菌落，放入無菌的三角瓶?jī)?nèi)，再加入0.5%甲醛，37 ℃滅活18h備用［9］。

1.3.2 蛋雞飼養(yǎng)管理 海蘭褐蛋雞20只，單籠、三層階梯式飼養(yǎng)，日糧按照NRC 蛋雞高峰日糧標(biāo)準(zhǔn)配制［10］，自由采食，自由飲水，室內(nèi)溫度（24±2）℃，相對(duì)濕度（70±10）%，光照時(shí)間12～16h，光照強(qiáng)度16Lux。

1.3.3 免疫工藝 用PBS溶液調(diào)節(jié)1.3.1抗原菌液至細(xì)菌數(shù)為2×108CFU／mL，與弗氏佐劑1∶1磁力攪拌混合后制備抗原乳液，于母雞翅下肌肉注射抗原乳液1.0mL 進(jìn)行首免，3、5周后相同劑量進(jìn)行強(qiáng)化免疫。首免8周后，收集雞蛋于冰箱中備用。

1.3.4 IgY 提取率的測(cè)定

（1）雞標(biāo)準(zhǔn)IgY 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取比色管6 支，分別加入0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL濃度為100μg／mL的雞標(biāo)準(zhǔn)IgY 溶液，加水定容至1mL，再分別加入1.0g／L 考馬斯亮藍(lán)G－250 染色液，搖勻，靜置5 min，595nm 下測(cè)吸光度。以雞標(biāo)準(zhǔn)IgY 溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［11］。

（2）IgY 提取率的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取0.05g IgY 粗品，加水定容至100mL，再逐級(jí)稀釋至合適倍數(shù)（將待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度控制在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)），按1.3.4（1）的方法取1mL在595nm 下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算稀釋液中IgY質(zhì)量濃度。根據(jù)式（1）計(jì)算粗品中IgY 質(zhì)量濃度，根據(jù)式（2）計(jì)算IgY 提取率。

式中：

y—— 粗品中IgY 質(zhì)量濃度，μg／g；

100——0.05g粗品溶解液體積，mL；

c—— 粗品稀釋液液中IgY 質(zhì)量濃度，μg／mL；

n—— 粗品稀釋倍數(shù)；

m1——IgY 粗品取樣量，g；

Y——IgY 提取率，mg／g；

m2—— 粗品總質(zhì)量，g；

M—— 蛋黃取樣量，g。

1.3.5 IgY 活性保留率的測(cè)定

（1）IgY 滴 定 度 的 測(cè) 定：參 照 文 獻(xiàn)［12］、［13］，采 用ELISA 法測(cè)定IgY 滴定度。修改如下：①包被：用包被液將豬源致病性大腸桿菌抗原稀釋至2×108CFU／mL，加入酶標(biāo)板，100μL／孔，4 ℃過夜；②洗滌：甩干包被液，用pH 7.4的PBST 洗 滌3 次，每 次3 min；③ 封 閉：加 入 封 閉 液100μL／孔，37 ℃濕盒溫育2.5h，甩干，洗滌同步驟②；④加樣：分別加入IgY 粗品稀釋液，稀釋液質(zhì)量濃度2μg／mL，重復(fù)3次，100μL／孔，37℃濕盒溫育60min，甩干，洗滌同步驟②；⑤加酶標(biāo)二抗：加羊抗雞HRP－IgG（1∶10 000），每孔100μL，37 ℃濕盒溫育60min。甩干，洗滌同步驟②；⑥加底物：加入鄰苯二胺溶液100μL／孔，避光室溫作用15min；⑦終止：滴加100μL／孔終止液；⑧測(cè)值：酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定OD450值；⑨判斷方法：P／N 為被檢樣本OD 值／陰性對(duì)照OD 值，P／N ＞2.1為陽(yáng)性，P／N ＜2.1為陰性。

（2）IgY 活性保留率的計(jì)算：按式（3）進(jìn)行。

式中：

r——IgY 活性保留率，%；

OD1—— 處理前溶液吸光度值；

OD2—— 處理后溶液吸光度值。

1.3.6 IgY 的分離工藝的確定

（1）稀釋倍數(shù)對(duì)IgY 分離效果的影響：雞蛋洗凈，0.5%新潔爾滅浸泡20min后自然晾干，去除蛋清獲取蛋黃，挑破卵黃膜，收集蛋黃液，稱取蛋黃20.00g用5，6，7，8，9，10倍體積PBS 進(jìn) 行 稀 釋，攪 拌 均 勻，0.1 mol／L HCl調(diào)pH 至5.2，4 ℃靜置12h，離心（10 000r／min，4 ℃）30min得水溶性組分（WSF），再加入8%PEG6000 100mL，攪拌30min后離心，收集沉淀，透析后凍干得IgY 粗品。以提取率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察稀釋倍數(shù)對(duì)分離效果的影響。

（2）溶液pH 值對(duì)IgY 分離效果的影響：設(shè)定稀釋倍數(shù)為8，靜置時(shí)間12h，PEG6000濃度8%，調(diào)節(jié)溶液pH 分別為4.0，4.4，4.8，5.2，5.6，6.0，按 照1.3.6（1）進(jìn) 行 試 驗(yàn)。以提取率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察溶液pH 值對(duì)分離效果的影響。

（3）靜置時(shí)間對(duì)IgY 分離效果的影響：設(shè)定稀釋倍數(shù)為8，溶液pH 為5.2，PEG6000濃度為8%，靜置時(shí)間分別為2，4，6，8，10，12h，按照1.3.6（1）進(jìn)行試驗(yàn)。以提取率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察靜置時(shí)間對(duì)分離效果的影響。

（4）PEG6000濃度對(duì)IgY 分離效果的影響：設(shè)定稀釋倍數(shù)為8，溶液pH 為5.2，靜置時(shí)間為12h，調(diào)節(jié)PEG6000濃度分別為2%，4%，6%，8%，10%，12%，按照1.3.6（1）進(jìn)行試驗(yàn)。以提取率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察PEG6000 濃度對(duì)分離效果的影響。

（5）最佳分離條件的確定：根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取稀釋倍數(shù)、溶液pH 值、靜置時(shí)間、PEG6000濃度為因素，進(jìn)行L9（43）正交試驗(yàn)，以IgY 提取率為指標(biāo)，考察四因素對(duì)IgY 分離效果的影響，同時(shí)獲取最佳分離條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以雞標(biāo)準(zhǔn)IgY 標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，595nm 下吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 雞標(biāo)準(zhǔn)IgY 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of yolk immunoglobulin

由圖1可知，在0～100μg／mL范圍內(nèi)，雞標(biāo)準(zhǔn)IgY 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y ＝0.004 1x－0.001 9，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 4，結(jié)果符合朗伯比爾定律，表明線性良好，可用于IgY 粗品中IgY 質(zhì)量濃度的測(cè)定。

2.2 分離條件的確定

2.2.1 稀釋倍數(shù)對(duì)IgY 分離效果的影響 由圖2可知，隨著稀釋倍數(shù)的增加，IgY 提取率先增后減。當(dāng)稀釋倍數(shù)為8時(shí)，IgY 提取率達(dá)到最大值。這主要是因?yàn)镮gY 為可溶性蛋白質(zhì)，分子表面有較多的親水性基團(tuán)，與水接觸時(shí)會(huì)迅速吸引水分子形成水化膜和乳狀液，水越多，IgY 溶解效果越好，提取率就越高。當(dāng)稀釋倍數(shù)大于8時(shí)，IgY 提取率降低的原因可能是過量的水溶解了蛋黃中可溶性大分子蛋白質(zhì)，在其吸引水分子的過程中會(huì)與IgY 爭(zhēng)奪水分子，從而導(dǎo)致IgY 提取率降低。

圖2 稀釋倍數(shù)對(duì)IgY 分離效果的影響Figure 2 Effect of dilution multiple on the yield of yolk immunoglobulin

另外，在試驗(yàn)中還觀察到，當(dāng)稀釋倍數(shù)低于7時(shí)，IgY 粗提液呈黃色乳狀液，有少量顆粒較小的黃色脂肪球，表明其中含有較多脂蛋白，分離效果不好；而稀釋倍數(shù)≥8時(shí)，溶液澄清度逐漸變高，分離效果較好。從分離效果及鹽析成本考慮采用稀釋倍數(shù)為8左右進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.2.2 溶液pH 值對(duì)IgY 分離效果的影響 由圖3可知，隨著pH 值的增加，IgY 提取率先增大后快速降低，當(dāng)溶液pH 值為5.2時(shí)達(dá)到最大值。這種現(xiàn)象主要是由蛋白質(zhì)等電點(diǎn)造成的，當(dāng)溶液pH 值接近IgY 等電點(diǎn)（pI＝5.2）時(shí)，分子凈電荷為零，蛋白質(zhì)分子在溶液中因沒有同種電荷的相互排斥，顆粒間極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，因此提取率高，而溶液pH 值遠(yuǎn)離pI時(shí)，電荷增大，排斥力增加，提取率降低。

此外，當(dāng)溶液pH 值在4.8～5.6時(shí)，上清液清澈，脂蛋白含量很少，超出此范圍時(shí)，溶液呈黃色乳狀液，脂蛋白與可溶性蛋白沒有完全分離。為了更好的去除脂蛋白，獲取較高的IgY 提取率，選擇pH＝5.0左右進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖3 溶液pH 值對(duì)IgY 分離效果的影響Figure 3 Effect of pH of solutions on the yield of yolk immunoglobulin

2.2.3 靜置時(shí)間對(duì)IgY 分離效果的影響 由圖4可知，在2～8h時(shí)，IgY 提取率隨靜置時(shí)間的延長(zhǎng)而快速增大，當(dāng)靜置時(shí)間大于8h時(shí)，IgY 提取率略有增大，但增加幅度很小。這主要是因?yàn)樵跉潆x子和PEG6000的作用下，IgY 分子失去了水化膜的保護(hù)和同種電荷的排斥，通過布朗運(yùn)動(dòng)由小聚大而沉淀下來，但I(xiàn)gY 微粒非常微小，聚合成大顆粒的時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)酸性離子與脂蛋白相互作用也需要一定時(shí)間。為節(jié)省時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，選用靜置時(shí)間為8h左右進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.4 PEG6000濃度對(duì)IgY 分離效果的影響 由圖5 可知，隨著PEG6000濃度的增大，IgY 提取率先增加后降低。當(dāng)濃度增加至8.0%時(shí)，IgY 提取率達(dá)到最大值。IgY 提取率隨PEG6000濃度增加而增加的原因主要有兩個(gè)：①因?yàn)镻EG 為非離子型聚合物，親水性強(qiáng)，它通過空間位置排斥使蛋白質(zhì)在水中的分配系數(shù)降低，迫使溶液中蛋白質(zhì)聚集而沉淀［6］，濃度越大，沉淀效果越好。②因?yàn)镻EG 易與蛋白質(zhì)疏水區(qū)碰撞，形成可逆性沉淀復(fù)合物，與蛋白質(zhì)共沉淀［14］。當(dāng)PEG6000濃度大于8.0%時(shí)，IgY 提取率緩慢降低，這主要是因?yàn)镻EG 對(duì)各種蛋白質(zhì)的空間位阻效應(yīng)、沉降系數(shù)、分子絮凝能力、親水性和夾帶析出效果各不相同［15］，當(dāng)濃度大于8.0%以后，適合PEG6000 與卵黃中較大分子蛋白質(zhì)共沉，而對(duì)IgY 共沉的效果并不好，因此提取率降低。

圖4 靜置時(shí)間對(duì)IgY 分離效果的影響Figure 4 Effect of standing time on the yield of yolk immunoglobulin

圖5 PEG6000濃度對(duì)IgY 提取率的影響Figure 5 Effect of density of PEG6000on the yield of yolk immunoglobulin

2.2.5 最佳分離條件的確定 以稀釋倍數(shù)、溶液pH 值、靜置時(shí)間、PEG6000濃度為因素，IgY 提取率為指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)來考察四因素對(duì)IgY 分離效果的影響。正交試驗(yàn)因素水平見表1，采用Excel 2007對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

由表2可知，各因素對(duì)IgY 提取率的影響次序?yàn)镈＞A＞C＞B，即PEG6000濃度對(duì)IgY 提取率影響最大，其次是稀釋倍數(shù)，溶液pH 值對(duì)提取率的影響最小。最佳組合為A2B2C2D2，即稀釋8倍、溶液pH 值5.2、靜置時(shí)間8h、DPEG6000濃度8%。

表2 分離條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of extracion

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

因?yàn)锳2B2C2D2的提取條件不在正交試驗(yàn)表中，所以按此提取條件補(bǔ)做3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)定IgY 提取率及其IgY 活性保留率，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果及活性保留率測(cè)定Table 3 Verification test of optimal extracion conditions

由表3 可知，在設(shè)定的提取條件下，IgY 提取率較高（13.69mg／g）且穩(wěn)定，平均得率超過正交試驗(yàn)最大值，具有可行性和實(shí)用價(jià)值。IgY 活性保留率測(cè)定結(jié)果表明，平均IgY 活性保留率達(dá)到94.15%。

3 結(jié)論

PEG6000為非離子型聚合物，其作用與有機(jī)溶劑相似，可選擇性地使蛋白質(zhì)沉淀，適合從含有大量大分子蛋白和磷脂的原始材料中選擇性沉淀小分子蛋白質(zhì)，具有條件溫和、大分子蛋白殘留量少等優(yōu)點(diǎn)，目前已被成功用于許多病毒的沉淀［16］。本試驗(yàn)以水稀釋法為基礎(chǔ)，結(jié)合PEG6000沉淀對(duì)卵黃中IgY 進(jìn)行提取，結(jié)果顯示該方法簡(jiǎn)單，快速，IgY 提取率較高且比較穩(wěn)定，獲得的IgY 活性保留率非常高，是一種可望用于工業(yè)化生產(chǎn)的方法。

何錫忠等［17］研究表明PEG 可以較好的使得小分子蛋白質(zhì)沉淀下來，且顆粒較小的圓形病毒需要較高濃度的PEG來沉淀。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)PEG6000濃度對(duì)IgY 提取率影響最大，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)IgY 提取率隨著PEG6000濃度的增加先增加后降低，但降低的原因是否與IgY 分子大小有關(guān)還需進(jìn)一步研究。另外，據(jù)報(bào)道［18］，PEG 的沉淀效果不僅取決于小分子蛋白的特性、濃度，還取決于溶液中鹽的濃度，而本試僅僅考慮了稀釋倍數(shù)、溶液pH 值、靜置時(shí)間、PEG6000濃度等因素對(duì)IgY 提取率的影響，未添加鹽類物質(zhì)，這一點(diǎn)也有待進(jìn)一步的試驗(yàn)和驗(yàn)證。

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