趙玉萍 陳曉旺

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

農(nóng)作物秸稈、稻殼和森林廢棄物在內(nèi)的木質(zhì)纖維素類(lèi)物質(zhì)是世界上最廣泛的可再生資源，是最具前景的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)原料。天然的纖維素物質(zhì)除了本身更加致密的晶體結(jié)構(gòu)外，一般還含有半纖維素和木質(zhì)素等，這些物質(zhì)“包裹”在纖維素外側(cè)，形成了纖維素的天然屏障［1］，因此利用木質(zhì)纖維素在技術(shù)上和成本上具有較大的挑戰(zhàn)。當(dāng)前水解木質(zhì)纖維素主要有3條途徑：酸解法、酶解法和微生物降解法［2］。酸解法因?qū)Νh(huán)境污染大而較少應(yīng)用，酶解法和生物水解法因其處理過(guò)程溫和、能耗低、設(shè)備要求低而備受關(guān)注［3］。據(jù)報(bào)道［4－7］，降解木質(zhì)素的微生物有白腐真菌、褐腐真菌和軟腐真菌，其中白腐真菌以其酶活高、酶系完全成為研究的熱點(diǎn)。木質(zhì)素的降解主要依賴(lài)3種酶，即漆酶（Lac）、錳過(guò)氧化物酶（MnP）和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP），其中漆酶是一種結(jié)合多個(gè)銅離子的多酚氧化酶，能催化各種芳烴類(lèi)化合物（特別是酚類(lèi)）的氧化［8］。由白腐真菌產(chǎn)生的漆酶因其來(lái)源廣泛、催化活性強(qiáng)而具有廣泛應(yīng)用前景和價(jià)值，但因酶活不高，一直以來(lái)是研究的熱點(diǎn)［9］。

本試驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室保藏白腐真菌，采用響面法優(yōu)化產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基提高酶活，為漆酶的進(jìn)一步研究及工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種：白腐真菌，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

超凈工作臺(tái)：BCM－1000，上海和呈儀器制造有限公司；

恒溫?fù)u床：QYC－211，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 培養(yǎng)基及配制方法

（1）斜面培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基。

（2）種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g，硫酸銨3.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO41.0g ，Na2HPO40.2 g，MnSO40.035g，CuSO4·5H2O 0.007g，吐溫－80 3mL，加蒸餾水至1 000mL。

（3）初始發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：麩皮10g，葡萄糖10g，硫酸銨0.1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO41.0g，Na2HPO40.2g，MnSO40.035g，CuSO4·5H2O 0.007g，吐 溫－80 3mL，加蒸餾水至1 000mL［10］。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)條件 種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基裝液量均為100mL／250mL三角瓶，搖瓶中加入10顆玻璃珠。搖床條件均為28℃、150r／min。種子培養(yǎng)時(shí)間為24h，接種量為10%。

1.3.2 酶活測(cè)定

（1）粗酶液制備：取發(fā)酵液8 000r／min離心10min，上清液即為粗酶液。

（2）漆酶活性測(cè)定：參照文獻(xiàn)［11］、［12］修改如下：4mL的反應(yīng)混合液中，含有3.4mL 0.1mol／L的pH 4.0的醋酸鈉緩沖液，0.5mL 3.34mmol／L 甲苯胺，0.1 mL 適當(dāng)稀釋的酶液，于40℃下反應(yīng)5min，測(cè)600nm 處的OD 值，1個(gè)酶活單位用每分鐘OD 值增加0.1來(lái)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 初始酶活

根據(jù)上述培養(yǎng)條件，采用起始產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)定漆酶酶活，其酶活變化曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 起始發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中漆酶酶活曲線(xiàn)Figure 1 Laccase activity curve of original enzyme production medium

由圖1 可知，菌株發(fā)酵至13 d 時(shí)酶活達(dá)到最高22.5U／mL。

2.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)基的條件優(yōu)化

研究不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響，氮源濃度及其它條件均同發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基。分別以（NH4）2SO4、酒石酸銨、NH4NO3、蛋白胨、酵母膏作為不同的氮源作產(chǎn)酶研究。最大酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳氮源為酒石酸銨，其酶活可達(dá)26.4U／mL。

圖2 不同氮源對(duì)酶活的影響Figure 2 Effect of difference nitrogen sources on Lac activity

2.3 確定主要因素

從麩皮、葡萄糖、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸銅、吐溫－80 這9 種因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，初步篩選出對(duì)菌株產(chǎn)酶影響較大的3種因素，然后通過(guò)Design－Expert軟件進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)，根據(jù)軟件所提供的各種條件進(jìn)行試驗(yàn)。

在原有發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，在其它因素不變的情況下，僅對(duì)麩皮添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，其添加量分別為5.0，7.5，10.0，12.5，15.0g／L，測(cè)定酶活。依據(jù)相同的方法作其它單因素試驗(yàn)，分別改變葡萄糖、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸銅和吐溫－80的添加量，結(jié)果見(jiàn)圖3～5。

圖3 不同質(zhì)量麩皮、葡萄糖和酒石酸銨對(duì)Lac酶活的影響Figure 3 Effects of difference concentrations of wheat bran，glucose and ammonium tartrate on Lac activity

圖4 不同質(zhì)量磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和硫酸鎂對(duì)Lac酶活的影響Figure 4 Effects of difference concentrations of KH2PO4，Na2HPO4and MgSO4on Lac activity

由圖3～5可知，麩皮、酒石酸銨、吐溫－80 3種物質(zhì)對(duì)酶活影響較大，其它因素影響不明顯，確定麩皮、酒石酸銨和吐溫－80為主要影響因素。

2.4 顯著影響因子的Box－Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)Box－Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)矩陣和結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 漆酶的響應(yīng)面結(jié)果與分析

利用Design－Expert軟件對(duì)表中試驗(yàn)數(shù)據(jù)的二次多項(xiàng)回歸模型進(jìn)行方差分析和回歸擬合，以發(fā)酵液漆酶酶活為響應(yīng)值Y，其結(jié)果見(jiàn)表3。

圖5 不同質(zhì)量硫酸錳、硫酸銅和吐溫－80對(duì)Lac酶活的影響Figure 5 Effects of difference concentrations of MnSO4，CuSO4and Tween－80on Lac activity

表1 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平表Table 1 Levels of the variables in the Box－Behnken experimental design

回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性由F 檢驗(yàn)來(lái)判定，P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由表3可知，一次項(xiàng)系數(shù)X1、X2、X3，二次項(xiàng)系數(shù)X21、X22、X23，交互項(xiàng)系數(shù)X1X3的P 值均小于0.05，說(shuō)明這些因素對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)漆酶酶活影響顯著。而交互項(xiàng)X1X2、X2X3的P 值均大于0.05，說(shuō)明X1與X2、X2與X3之間的相互作用小，對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶酶活影響不顯著。經(jīng)過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸分析，得到二次多元回歸方程：

表2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)矩陣和結(jié)果Table 2 Design matrix and results of response surface methodology

表3 漆酶的方差及顯著性分析結(jié)果Table 3 Variance and significance analysis of Lac activity

由表3可知，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝96.74%，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有96.74%來(lái)源于所選變量。因此該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程對(duì)本試驗(yàn)產(chǎn)木質(zhì)素酶降解菌株發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

根據(jù)響應(yīng)面回歸方程利用Design－Expert軟件繪制的響應(yīng)曲面圖和等高線(xiàn)圖，見(jiàn)圖6～8。

圖6 麩皮和酒石酸銨對(duì)漆酶表達(dá)的響應(yīng)面與等高線(xiàn)圖Figure 6 Response surface and corresponding contour plot（wheat bran，ammonium tartrate）

每個(gè)響應(yīng)面分別代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用。由圖6～8可知，麩皮、酒石酸銨和吐溫－80與漆酶產(chǎn)量存在顯著的相關(guān)性。當(dāng)酒石酸銨和吐溫－80維持固定在最佳水平時(shí)，麩皮的添加量由7.50g／L 升至11.04g／L 時(shí)，漆酶產(chǎn)量隨之升高，當(dāng)超過(guò)11.04g／L時(shí)，漆酶產(chǎn)量開(kāi)始下降。同時(shí)，由相應(yīng)的等高線(xiàn)圖可以看出，麩皮和酒石酸銨、吐溫－80和酒石酸銨、麩皮和吐溫－80 的等高線(xiàn)均呈橢圓形，交互作用顯著。

2.6 菌株發(fā)酵最佳條件的確定及檢驗(yàn)

為確定本試驗(yàn)產(chǎn)纖維素酶菌株最佳的發(fā)酵條件，根據(jù)Design－Expert軟件分析和預(yù)測(cè)，獲得漆酶酶活最大值時(shí)，主要因素麩皮、酒石酸銨和吐溫－80 的優(yōu)化值分別為11.04，0.10g／L和3.24mL／L。根據(jù)模型的預(yù)測(cè)，菌株在優(yōu)化后的條件下發(fā)酵產(chǎn)生Lac酶酶活最大值為34.25U／mL。

圖7 吐溫－80和酒石酸銨對(duì)漆酶表達(dá)的響應(yīng)面與等高線(xiàn)圖Figure 7 Response surface and corresponding contour plot（Tween－80，ammonium tartrate）

圖8 麩皮和吐溫－80對(duì)漆酶表達(dá)的響應(yīng)面與等高線(xiàn)圖Figure 8 Response surface and corresponding contour plot（Tween－80，wheat bran）

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)值與實(shí)際試驗(yàn)值之間的相關(guān)性，即檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性，對(duì)菌株在預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件下發(fā)酵產(chǎn)酶能力進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，測(cè)得其發(fā)酵后的Lac 酶酶活為36.67U／mL，與預(yù)測(cè)值十分接近。優(yōu)化后酶活與比優(yōu)化前提高了62.98%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用白腐真菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶，利用Design－Expert軟件在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面分析影響漆酶酶活的主要因素為麩皮、酒石酸銨和吐溫－80，研究了在最優(yōu)條件下，Lac酶的最大酶活可達(dá)36.67 U／mL，比優(yōu)化前提高了62.98%，證明該方法提高漆酶酶活切實(shí)可行。

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