張 慧 鄭曉冬 姜 侃 汪 新 陳小珍
(1.浙江省質(zhì)量檢測(cè)科學(xué)研究院食品檢測(cè)部,浙江 杭州 310013;2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310058)
耐熱性霉菌是引起果蔬汁飲料腐敗的重要原因之一[1-3]。它可產(chǎn)生子囊孢子,能夠耐受巴氏殺菌或UHT 殺菌而存活下來,并能在缺氧的環(huán)境中生長,抗熱能力比其它霉菌強(qiáng)很多。受耐熱霉菌污染的果汁,在貯存期間易發(fā)生變色、分層、胖聽等,甚至產(chǎn)生絲衣霉毒素A、棒曲霉素等有毒的次生代謝產(chǎn)物[4-6],給食品安全帶來隱患,也給企業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失。一些企業(yè)尤其是出口型企業(yè),為滿足國際需求,通常要求產(chǎn)品中耐熱霉菌不得檢出。目前耐熱霉菌的檢測(cè)通常采用PDA 平板培養(yǎng)法,但檢測(cè)時(shí)間較長[1],影響了果蔬汁產(chǎn)品的快速流通。為保障國內(nèi)外消費(fèi)者的健康安全,急需尋找一種能夠快速檢測(cè)鑒別果汁中耐熱霉菌的方法。
雪白絲衣霉菌是果汁中易污染的耐熱霉菌之一[7-9],本試驗(yàn)根據(jù)雪白絲衣霉菌的beta-tubulin 基因序列,通過設(shè)計(jì)引物、條件優(yōu)化等建立PCR 快速檢測(cè)方法,力圖快速、準(zhǔn)確檢測(cè)果汁中雪白絲衣霉菌污染,為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供技術(shù)基礎(chǔ)。
1.1.1 菌株
本試驗(yàn)所用菌株見表1。
1.1.2 主要儀器
電子天平:AB104-N,上海第二天平儀器廠;
梯度PCR 儀:Veriti 96孔,美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;
電泳儀:Bio-Rad PowerPace Basic,美國伯樂公司;
自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng):Bio-Rad Gel Doc XR,美國伯樂公司;
高速離心機(jī):Microfuge 16,貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司。
1.1.3 主要試劑
Biospin真菌基因組DNA 提取試劑盒:杭州博日科技有限公司;
2×NI-Taq PCR MasterMix試劑、DL2 000DNA Marker、瓊脂糖:上海位點(diǎn)生物科技有限公司。
表1 試驗(yàn)菌株Table 1 Strains for test
1.2.1 菌株培養(yǎng) 雪白絲衣霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基,25 ℃培養(yǎng)3~5d,挑取菌絲體或菌絲球提取真菌DNA。
1.2.2 模板DNA 制備 真菌DNA 提取采用Biospin真菌基因組DNA 抽提試劑盒,操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。
1.2.3 引物設(shè)計(jì) 雪白絲衣霉菌引物設(shè)計(jì)參考GenBank CBS133.37beta tubulin的部分基因序列,雪白絲衣霉菌引物序列見表2,所有引物均由Invitrogen公司合成。
表2 引物組與退火溫度Table 2 Specific primer sequences and annealing temperatures
1.2.4 用于引物篩選的PCR 反應(yīng)體系和PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化 雪白絲衣霉菌的引物篩選和退火溫度的優(yōu)化同時(shí)進(jìn)行,引物篩選時(shí),使用雪白絲衣霉菌的引物,分別使用雪白絲衣霉菌(ATCC22260)、純黃絲衣霉(ATCC24474)、宛氏擬青霉(CICC4024)、費(fèi)氏新薩托菌(ATCC24474)的DNA 模板,通過不同退火溫度下引物的特異性篩選出合適的引物。
PCR 反應(yīng)條件:95 ℃(5min),98 ℃(10s)、梯 度 退火溫度(30s)、72℃(30s)、35個(gè)循環(huán),72℃(5min);做梯度PCR進(jìn)行引物篩選和條件優(yōu)化時(shí),退火溫度梯度選擇:55,57,59,61,63,65 ℃。4 ℃保存。
引物濃度的優(yōu)化:使用優(yōu)化的退火溫度,引物的終濃度分別達(dá)到0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5μmol/L,進(jìn)行PCR 試驗(yàn)。
表3 PCR 反應(yīng)體系組成Table 3 PCR reaction
1.2.5 特異性驗(yàn)證 分別應(yīng)用2株雪白絲衣霉菌和6株非雪白絲衣霉菌,提取其基因組DNA 進(jìn)行PCR 檢測(cè),驗(yàn)證該方法檢測(cè)雪白絲衣霉的特異性。
1.2.6 靈敏度試驗(yàn) 以標(biāo)準(zhǔn)菌株:雪白絲衣霉ATCC22260為參考菌株,進(jìn)行靈敏度測(cè)定,將菌株DNA 提取液進(jìn)行10倍梯度稀 釋,使DNA 濃度 約 為10,1,10-1,10-2,10-3,10-4ng/μL,DNA 模板用量為1.0μL,應(yīng)用以上DNA 進(jìn)行PCR 檢測(cè),電泳觀察結(jié)果。
1.2.7 PCR 產(chǎn)物電泳 取5μL PCR產(chǎn)物,應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),電泳條件為0.5×TBE、2.0%瓊脂糖凝膠、150V電壓條件下電泳30min,凝膠電泳成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果。
運(yùn)用梯度PCR 方法對(duì)雪白絲衣霉進(jìn)行擴(kuò)增,并對(duì)該菌不同退火溫度下的引物特異性進(jìn)行考察,使用兩對(duì)引物進(jìn)行PCR 反應(yīng),擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1、2。使用Bn-1引物的雪白絲衣霉(圖1)在退火溫度55,57,59,61,63 ℃時(shí),123bp處均有目的條帶出現(xiàn),59 ℃時(shí)呈現(xiàn)最強(qiáng)熒光,而在這些退火溫度均無非特性擴(kuò)增出現(xiàn),說明引物適合雪白絲衣霉的DNA 擴(kuò)增,并具有良好的特異性。使用Bn-2引物進(jìn)行梯度PCR 反應(yīng)時(shí)(圖2),雪白絲衣霉在55,57,59,61 ℃時(shí),均有72bp的目的條帶出現(xiàn);同時(shí),純黃絲衣霉在這幾個(gè)溫度均有明顯的非特異性擴(kuò)增,退火溫度提升到63 ℃時(shí),純黃絲衣霉非特異性擴(kuò)增消失,但此時(shí)雪白絲衣霉的條帶亮度很弱;宛氏擬青霉在55,57 ℃時(shí)也出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增,但隨著退火溫度的升高,非特異條帶逐漸減弱,退火溫度達(dá)到59 ℃以上時(shí),即可消除宛氏擬青霉非特異擴(kuò)增的影響。
綜合考慮,選擇擴(kuò)增后有目的條帶出現(xiàn),并且引物特異性較好的Bn-1引物,作為雪白絲衣霉PCR 擴(kuò)增的引物;選擇59 ℃作為以后PCR 擴(kuò)增的退火溫度。
圖1 雪白絲衣霉(使用Bn-1引物)梯度PCR 反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 1 Electrophoresis of Gradient PCR products of Byssochlamys nivea
圖2 雪白絲衣霉(使用Bn-2引物)梯度PCR 反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 2 Electrophoresis of Gradient PCR products of Byssochlamys nivea(Bn-2primers)
按照篩選的引物和優(yōu)化的退火溫度,對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。由圖3可知,除了引物終濃度在0μmol/L 時(shí)沒有條帶,引物濃度在0.1μmol/L 以上的均在預(yù)期位置擴(kuò)增出清晰的目的條帶。因此,從0.1~0.5μmol/L均可滿足PCR對(duì)引物濃度的要求。既保證條帶明亮、清晰,又考慮到節(jié)約成本,選用0.2μmol/L為優(yōu)化的引物終濃度。
特異性試驗(yàn)結(jié)果見圖4。2 株雪白絲衣霉均呈陽性擴(kuò)增,其它幾種霉菌和細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果均為陰性,說明該法只與雪白絲衣霉發(fā)生特異性反應(yīng),不與其它真菌或細(xì)菌菌株產(chǎn)生交叉反應(yīng),設(shè)計(jì)的引物特異性很強(qiáng),與預(yù)期結(jié)果相符。
圖3 引物濃度對(duì)PCR 擴(kuò)增的影響Figure 3 Effect of primers concentration on PCR amplification
圖4 雪白絲衣霉及非雪白絲衣霉PCR 反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 4 Electrophoresis of PCR products of Byssochlamys nivea and non-Byssochlamys nivea
圖5 雪白絲衣霉PCR 檢測(cè)靈敏度Figure 5 Sensitivity of PCR for Byssochlamys nivea
分別以不同的雪白絲衣霉DNA 模板濃度對(duì)PCR 方法的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行測(cè)試。由圖5可知,隨著DNA模板濃度的降低,反應(yīng)條帶的亮度呈梯度下降,當(dāng)DNA 模板濃度降至1ng/μL時(shí)仍可見較為明亮的目的擴(kuò)增條帶,因此檢測(cè)靈敏度約為1ng/PCR 反應(yīng)體系。
本試驗(yàn)根據(jù)Genbank公布的耐熱性霉菌——雪白絲衣霉的beta-tubulin基因序列,設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物,參考文獻(xiàn)[10]并結(jié)合經(jīng)驗(yàn),初步設(shè)定反應(yīng)體系與溫度循環(huán)和退火溫度的梯度程序,通過兩對(duì)引物PCR 擴(kuò)增效果的對(duì)比,發(fā)現(xiàn)引物Bn-1既能擴(kuò)增出目的DNA 片段,又具有良好的特異性;59 ℃的退火溫度和0.2μM/PCR 反應(yīng)體系的引物濃度,在滿足試驗(yàn)需求的同時(shí),也節(jié)約了成本,為PCR 反應(yīng)的最佳條件;以優(yōu)化的PCR 條件對(duì)雪白絲衣霉和非雪白絲衣霉進(jìn)行PCR 檢測(cè),試驗(yàn)結(jié)果表明所建立的PCR 方法對(duì)雪白絲衣霉具有良好的特異性,方法基因組DNA 的靈敏度為1ng/PCR 反應(yīng)體系,檢測(cè)靈敏度好。雪白絲衣霉PCR 檢測(cè)方法的建立,為果汁中耐熱霉菌的快速檢測(cè)和鑒別提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
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