張 慧 鄭曉冬 姜 侃 汪 新 陳小珍

（1.浙江省質(zhì)量檢測(cè)科學(xué)研究院食品檢測(cè)部，浙江 杭州 310013；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

耐熱性霉菌是引起果蔬汁飲料腐敗的重要原因之一［1－3］。它可產(chǎn)生子囊孢子，能夠耐受巴氏殺菌或UHT 殺菌而存活下來，并能在缺氧的環(huán)境中生長，抗熱能力比其它霉菌強(qiáng)很多。受耐熱霉菌污染的果汁，在貯存期間易發(fā)生變色、分層、胖聽等，甚至產(chǎn)生絲衣霉毒素A、棒曲霉素等有毒的次生代謝產(chǎn)物［4－6］，給食品安全帶來隱患，也給企業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失。一些企業(yè)尤其是出口型企業(yè)，為滿足國際需求，通常要求產(chǎn)品中耐熱霉菌不得檢出。目前耐熱霉菌的檢測(cè)通常采用PDA 平板培養(yǎng)法，但檢測(cè)時(shí)間較長［1］，影響了果蔬汁產(chǎn)品的快速流通。為保障國內(nèi)外消費(fèi)者的健康安全，急需尋找一種能夠快速檢測(cè)鑒別果汁中耐熱霉菌的方法。

雪白絲衣霉菌是果汁中易污染的耐熱霉菌之一［7－9］，本試驗(yàn)根據(jù)雪白絲衣霉菌的beta－tubulin 基因序列，通過設(shè)計(jì)引物、條件優(yōu)化等建立PCR 快速檢測(cè)方法，力圖快速、準(zhǔn)確檢測(cè)果汁中雪白絲衣霉菌污染，為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

本試驗(yàn)所用菌株見表1。

1.1.2 主要儀器

電子天平：AB104－N，上海第二天平儀器廠；

梯度PCR 儀：Veriti 96孔，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；

電泳儀：Bio－Rad PowerPace Basic，美國伯樂公司；

自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)：Bio－Rad Gel Doc XR，美國伯樂公司；

高速離心機(jī)：Microfuge 16，貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司。

1.1.3 主要試劑

Biospin真菌基因組DNA 提取試劑盒：杭州博日科技有限公司；

2×NI－Taq PCR MasterMix試劑、DL2 000DNA Marker、瓊脂糖：上海位點(diǎn)生物科技有限公司。

表1 試驗(yàn)菌株Table 1 Strains for test

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 雪白絲衣霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)3～5d，挑取菌絲體或菌絲球提取真菌DNA。

1.2.2 模板DNA 制備 真菌DNA 提取采用Biospin真菌基因組DNA 抽提試劑盒，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 雪白絲衣霉菌引物設(shè)計(jì)參考GenBank CBS133.37beta tubulin的部分基因序列，雪白絲衣霉菌引物序列見表2，所有引物均由Invitrogen公司合成。

表2 引物組與退火溫度Table 2 Specific primer sequences and annealing temperatures

1.2.4 用于引物篩選的PCR 反應(yīng)體系和PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化 雪白絲衣霉菌的引物篩選和退火溫度的優(yōu)化同時(shí)進(jìn)行，引物篩選時(shí)，使用雪白絲衣霉菌的引物，分別使用雪白絲衣霉菌（ATCC22260）、純黃絲衣霉（ATCC24474）、宛氏擬青霉（CICC4024）、費(fèi)氏新薩托菌（ATCC24474）的DNA 模板，通過不同退火溫度下引物的特異性篩選出合適的引物。

PCR 反應(yīng)條件：95 ℃（5min），98 ℃（10s）、梯 度 退火溫度（30s）、72℃（30s）、35個(gè)循環(huán)，72℃（5min）；做梯度PCR進(jìn)行引物篩選和條件優(yōu)化時(shí)，退火溫度梯度選擇：55，57，59，61，63，65 ℃。4 ℃保存。

引物濃度的優(yōu)化：使用優(yōu)化的退火溫度，引物的終濃度分別達(dá)到0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5μmol／L，進(jìn)行PCR 試驗(yàn)。

表3 PCR 反應(yīng)體系組成Table 3 PCR reaction

1.2.5 特異性驗(yàn)證 分別應(yīng)用2株雪白絲衣霉菌和6株非雪白絲衣霉菌，提取其基因組DNA 進(jìn)行PCR 檢測(cè)，驗(yàn)證該方法檢測(cè)雪白絲衣霉的特異性。

1.2.6 靈敏度試驗(yàn) 以標(biāo)準(zhǔn)菌株：雪白絲衣霉ATCC22260為參考菌株，進(jìn)行靈敏度測(cè)定，將菌株DNA 提取液進(jìn)行10倍梯度稀 釋，使DNA 濃度 約 為10，1，10－1，10－2，10－3，10－4ng／μL，DNA 模板用量為1.0μL，應(yīng)用以上DNA 進(jìn)行PCR 檢測(cè)，電泳觀察結(jié)果。

1.2.7 PCR 產(chǎn)物電泳 取5μL PCR產(chǎn)物，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳條件為0.5×TBE、2.0%瓊脂糖凝膠、150V電壓條件下電泳30min，凝膠電泳成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的篩選和退火溫度的優(yōu)化

運(yùn)用梯度PCR 方法對(duì)雪白絲衣霉進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)該菌不同退火溫度下的引物特異性進(jìn)行考察，使用兩對(duì)引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1、2。使用Bn－1引物的雪白絲衣霉（圖1）在退火溫度55，57，59，61，63 ℃時(shí)，123bp處均有目的條帶出現(xiàn)，59 ℃時(shí)呈現(xiàn)最強(qiáng)熒光，而在這些退火溫度均無非特性擴(kuò)增出現(xiàn)，說明引物適合雪白絲衣霉的DNA 擴(kuò)增，并具有良好的特異性。使用Bn－2引物進(jìn)行梯度PCR 反應(yīng)時(shí)（圖2），雪白絲衣霉在55，57，59，61 ℃時(shí)，均有72bp的目的條帶出現(xiàn)；同時(shí)，純黃絲衣霉在這幾個(gè)溫度均有明顯的非特異性擴(kuò)增，退火溫度提升到63 ℃時(shí)，純黃絲衣霉非特異性擴(kuò)增消失，但此時(shí)雪白絲衣霉的條帶亮度很弱；宛氏擬青霉在55，57 ℃時(shí)也出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增，但隨著退火溫度的升高，非特異條帶逐漸減弱，退火溫度達(dá)到59 ℃以上時(shí)，即可消除宛氏擬青霉非特異擴(kuò)增的影響。

綜合考慮，選擇擴(kuò)增后有目的條帶出現(xiàn)，并且引物特異性較好的Bn－1引物，作為雪白絲衣霉PCR 擴(kuò)增的引物；選擇59 ℃作為以后PCR 擴(kuò)增的退火溫度。

圖1 雪白絲衣霉（使用Bn－1引物）梯度PCR 反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 1 Electrophoresis of Gradient PCR products of Byssochlamys nivea

圖2 雪白絲衣霉（使用Bn－2引物）梯度PCR 反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 2 Electrophoresis of Gradient PCR products of Byssochlamys nivea（Bn－2primers）

2.2 引物濃度的優(yōu)化

按照篩選的引物和優(yōu)化的退火溫度，對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。由圖3可知，除了引物終濃度在0μmol／L 時(shí)沒有條帶，引物濃度在0.1μmol／L 以上的均在預(yù)期位置擴(kuò)增出清晰的目的條帶。因此，從0.1～0.5μmol／L均可滿足PCR對(duì)引物濃度的要求。既保證條帶明亮、清晰，又考慮到節(jié)約成本，選用0.2μmol／L為優(yōu)化的引物終濃度。

2.3 特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)結(jié)果見圖4。2 株雪白絲衣霉均呈陽性擴(kuò)增，其它幾種霉菌和細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說明該法只與雪白絲衣霉發(fā)生特異性反應(yīng)，不與其它真菌或細(xì)菌菌株產(chǎn)生交叉反應(yīng)，設(shè)計(jì)的引物特異性很強(qiáng)，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.4 靈敏度試驗(yàn)

圖3 引物濃度對(duì)PCR 擴(kuò)增的影響Figure 3 Effect of primers concentration on PCR amplification

圖4 雪白絲衣霉及非雪白絲衣霉PCR 反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 4 Electrophoresis of PCR products of Byssochlamys nivea and non－Byssochlamys nivea

圖5 雪白絲衣霉PCR 檢測(cè)靈敏度Figure 5 Sensitivity of PCR for Byssochlamys nivea

分別以不同的雪白絲衣霉DNA 模板濃度對(duì)PCR 方法的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行測(cè)試。由圖5可知，隨著DNA模板濃度的降低，反應(yīng)條帶的亮度呈梯度下降，當(dāng)DNA 模板濃度降至1ng／μL時(shí)仍可見較為明亮的目的擴(kuò)增條帶，因此檢測(cè)靈敏度約為1ng／PCR 反應(yīng)體系。

3 討論

本試驗(yàn)根據(jù)Genbank公布的耐熱性霉菌——雪白絲衣霉的beta－tubulin基因序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，參考文獻(xiàn)［10］并結(jié)合經(jīng)驗(yàn)，初步設(shè)定反應(yīng)體系與溫度循環(huán)和退火溫度的梯度程序，通過兩對(duì)引物PCR 擴(kuò)增效果的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)引物Bn－1既能擴(kuò)增出目的DNA 片段，又具有良好的特異性；59 ℃的退火溫度和0.2μM／PCR 反應(yīng)體系的引物濃度，在滿足試驗(yàn)需求的同時(shí)，也節(jié)約了成本，為PCR 反應(yīng)的最佳條件；以優(yōu)化的PCR 條件對(duì)雪白絲衣霉和非雪白絲衣霉進(jìn)行PCR 檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明所建立的PCR 方法對(duì)雪白絲衣霉具有良好的特異性，方法基因組DNA 的靈敏度為1ng／PCR 反應(yīng)體系，檢測(cè)靈敏度好。雪白絲衣霉PCR 檢測(cè)方法的建立，為果汁中耐熱霉菌的快速檢測(cè)和鑒別提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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