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        鰱魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)分析與回收

        2012-03-20 03:32:46許艷順姜啟興夏文水
        食品與機(jī)械 2012年6期
        關(guān)鍵詞:褐藻電泳分子量

        許艷順 高 琪 姜啟興 夏文水

        (江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇 無錫 214122)

        在魚制品加工中,魚糜制品因其高蛋白、低脂肪、口感嫩爽等特點(diǎn)已成為深受國內(nèi)外消費(fèi)者歡迎的水產(chǎn)加工大類產(chǎn)品,在中國已形成一定的產(chǎn)業(yè)化規(guī)模,并且發(fā)展迅速,產(chǎn)量和消費(fèi)量逐年增加。在魚糜生產(chǎn)過程中,魚肉必須經(jīng)過多次漂洗以除去部分阻礙魚糜凝膠形成和影響魚糜感官品質(zhì)的酶類、脂肪、色素、無機(jī)鹽等雜質(zhì),同時(shí)引起大量蛋白質(zhì)主要是水溶性蛋白質(zhì)的損失,導(dǎo)致魚糜得率降低[1]。漂洗廢水中一般含有0.5%~2.3%的蛋白質(zhì),直接排放不僅污染環(huán)境,同時(shí)還造成蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)[2]。因此,對(duì)魚糜漂洗廢水中蛋白質(zhì)進(jìn)行回收利用,可以降低魚糜漂洗廢水對(duì)環(huán)境的污染,同時(shí)可以提高資源利用率和企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

        近年來,對(duì)魚糜漂洗廢水中蛋白質(zhì)的回收利用已引起國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。目前魚糜漂洗廢水中蛋白回收方法主要有膜分離法[3]、絮凝法[4,5]、調(diào)節(jié)pH 值法[1,6]、電阻加熱法[7]等。膜分離法回收效果較好,但易導(dǎo)致膜污染;電阻加熱法耗能大,回收成本較高[8]。褐藻膠作為天然有機(jī)高分子絮凝劑對(duì)廢水中蛋白質(zhì)具有較好的絮凝效果,且回收蛋白可回添至魚糜中[9,10]。蛋白質(zhì)是帶有正電荷和負(fù)電荷基團(tuán)的兩性電解質(zhì),利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近較低的溶解性來沉淀回收漂洗液中蛋白質(zhì),操作簡單,成本低廉[1]。

        本試驗(yàn)對(duì)鰱魚糜不同漂洗階段的漂洗液中蛋白含量和組成進(jìn)行分析,并進(jìn)一步采用調(diào)節(jié)魚糜漂洗液pH 法和海藻膠絮凝法對(duì)漂洗液中蛋白質(zhì)進(jìn)行回收和分析,旨在為淡水魚糜加工過程中漂洗廢水的回收處理提供技術(shù)指導(dǎo)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 材料與試劑

        鰱魚:鮮活,體重2~3kg/條,購于無錫某農(nóng)貿(mào)市場;

        四甲基乙二胺(TEMED):純度≥99%,美國Sigma公司;

        丙烯酰胺、N,N”-亞甲基雙丙烯酰胺:

        純度>98%,瑞士Fluka Biochemica公司;

        β-巰基乙醇:純度98%,美國Amresco公司;

        蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn):寶生物工程(大連)有限公司;

        其它試劑:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        1.1.2 主要儀器設(shè)備

        高速冷凍離心機(jī):4K-15型,德國Sigma公司;

        紫外-可見分光光度計(jì):UV-1000型,上海天美科學(xué)儀器有限公司;

        pH 計(jì):320-s型,梅特勒-托利多儀器上海有限公司;

        多功能食品加工機(jī):SQ2119DX 型,上海帥佳電子科技有限公司;

        電泳儀:DYY-8C型,北京市六一儀器廠。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 魚糜漂洗液制備 將新鮮鰱魚去頭、內(nèi)臟,清水沖洗干凈后,采肉機(jī)采肉。漂洗時(shí)控制魚肉與水的比例為1∶4(m∶V),先慢速攪拌6min,再靜置10min,之后用4層紗布過濾,得到漂洗液置于4 ℃冰箱中備用(冷藏時(shí)間不超過24h)。在漂洗過程中應(yīng)控制溫度不超過10 ℃。用清水漂洗兩次后,第3次漂洗采用0.3% (m∶V)鹽水漂洗。所得到的3次漂洗液依次記為WS-Ⅰ,WS-Ⅱ和WS-Ⅲ。

        1.2.2 調(diào)節(jié)pH 法回收漂洗液蛋白質(zhì) 分別取30mL 魚糜漂洗液于100 mL 燒杯中,用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)漂洗液pH至pH 3.0~6.0(以0.5為梯度),漂洗液用蒸餾水分別補(bǔ)至40mL,然后在設(shè)定溫度條件下(4,21,30 ℃)靜置30min后4 000r/min離心10min,測定上清液的體積和蛋白質(zhì)濃度,計(jì)算蛋白質(zhì)回收率。

        1.2.3 褐藻膠絮凝法回收漂洗液蛋白質(zhì) 分別取30mL魚糜漂洗液于100mL錐形瓶中,用1mol/L HCl調(diào)節(jié)漂洗液pH 至3.0~6.0(以0.5為梯度),漂洗液用蒸餾水分別補(bǔ)至40mL,然后按100mg/L 添加1%褐藻膠溶液,錐形瓶用保鮮膜封口,放入搖床中,搖床參數(shù)設(shè)置為20 ℃,120r/min,5min后取出靜置30min,4 000r/min離心10min,收集上清液,測定上清液的體積和蛋白質(zhì)濃度,計(jì)算蛋白質(zhì)回收率。

        1.3 分析方法

        1.3.1 pH 的測定 采用pH 計(jì)直接測定。

        1.3.2 蛋白質(zhì)濃度測定 采用雙縮尿法。

        1.3.3 蛋白質(zhì)回收率計(jì)算 按式(1)計(jì)算:

        1.3.4 SDS-PAGE 電泳 采用Laemmli法。將電泳蛋白樣品與等體積的SDS-PAGE 樣品處理液(0.125 mol/L pH 6.8Tris-HCl緩沖液,4%SDS,20%甘油,10%β-巰基乙醇,0.005% 溴酚藍(lán))混合,沸水加熱5min后,采用4%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。起始電泳電壓為80V,待樣品進(jìn)入分離膠后改為120 V。電泳完成后,采用考馬斯亮藍(lán)R250染色,用醋酸甲醇溶液進(jìn)行脫色。

        蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物:肌球蛋白(200kDa),β-半乳糖苷 酶(116 kDa),磷 酸 酶b(97.2 kDa),牛 血 清 蛋 白(66.4kDa),卵清蛋白(44.3kDa),磷酸苷酶(29.0kDa),胰蛋白酶抑制劑(20.1kDa),溶菌酶(14.3kDa)。

        1.4 統(tǒng)計(jì)分析

        每組試驗(yàn)重復(fù)3次,取其平均值。所有數(shù)據(jù)采用Excel作圖,采用SPSS 11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 魚糜漂洗液中蛋白含量和組成分析

        由圖1可知,魚糜漂洗液中含有大量的蛋白質(zhì),3次漂洗液中蛋白質(zhì)濃度分別為WS-Ⅰ(12.37±0.09)mg/mL,WS-Ⅱ(3.12±0.09)mg/mL,WS-Ⅲ(1.75±0.07)mg/mL,隨著漂洗次數(shù)的增加,漂洗液中蛋白含量逐漸減少。由圖2 可知,漂洗液WS-Ⅰ中蛋白質(zhì)分子量分布在20.1~97.2kDa,其中主要蛋白組分集中在44.3kDa左右。漂洗液WS-Ⅱ和WS-Ⅲ中的蛋白質(zhì)分子量也大部分處于29.0~66.4kDa,但含量比WS-Ⅰ顯著減少。因此,在蛋白回收研究中采用漂洗液WS-Ⅰ。

        2.2 pH 值和溫度對(duì)蛋白回收效果的影響

        圖1 不同漂洗階段漂洗廢水中蛋白質(zhì)含量Figure 1 Protein concentration in surimi washwater at different wash stages

        圖2 漂洗廢水中蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖Figure 2 SDS-PAGE patterns of proteins in surimi wash-water at different stages

        蛋白質(zhì)是帶有正電荷和負(fù)電荷基團(tuán)的兩性電解質(zhì),pH值能夠改變氨基酸殘基側(cè)鏈的電荷分布和蛋白分子帶電基團(tuán)的電荷數(shù)量。當(dāng)環(huán)境pH 值偏離等電點(diǎn)越近,蛋白分子所帶的靜電荷越少,蛋白分子在等電點(diǎn)處所帶靜電荷為零,蛋白分子間的靜電斥力最小,蛋白分子趨于聚集沉淀。因此調(diào)節(jié)pH 值的變化能夠降低或增加蛋白質(zhì)之間的相互作用,從而影響蛋白質(zhì)聚集沉淀。

        不同pH 和溫度條件下魚糜漂洗液中蛋白回收效果見圖3。由圖3可知,在3個(gè)處理溫度條件下,隨著魚糜漂洗液pH 的降低,蛋白回收率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在pH 5.0處蛋白回收率均達(dá)到最大,在4,21,30℃3個(gè)不同處理溫度條件下蛋白質(zhì)最大回收率分別為42.73%,47.40%和54.81%。Bourtoom 等[1]通過調(diào)節(jié)pH 值對(duì)金線魚(threadfin bream)魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)的回收研究中發(fā)現(xiàn),蛋白回收率隨pH 的下降而下降,在pH 3.5除蛋白回收率最大,為66.3%。Chen等[11]通過等點(diǎn)聚焦電泳(IEF)研究發(fā)現(xiàn)魚肉水溶性蛋白組分的等電點(diǎn)在3.5~5.2,5.85~6.55 和7.35~8.15處。溫度對(duì)蛋白回收效果有顯著影響,在選擇的3個(gè)處理溫度條件下,蛋白回收率隨著溫度的增加而逐漸增加,這與Bourtoom 等的研究報(bào)道[1]一致。

        圖3 不同pH、溫度對(duì)蛋白質(zhì)回收效果的影響Figure 3 Effect of pH and temperature on recovery of proteins in surimi wash water

        由圖4可知,不同溫度條件下所得上清液中蛋白質(zhì)電泳圖譜相似,表明處理溫度對(duì)回收蛋白質(zhì)組成影響不大。但不同pH 條件下上清液中蛋白電泳圖譜條帶顯著不同,隨著pH 的降低,較高分子量蛋白條帶,尤其是分子量在44.3kDa左右的蛋白質(zhì)電泳條帶逐漸變淡,而低分子量蛋白質(zhì)(14.3~20.1kDa)的電泳條帶強(qiáng)度逐漸增加,表明隨著pH的降低,較高分子量蛋白質(zhì)部分水解為低分子量蛋白質(zhì),而且當(dāng)pH 值低于5.0 時(shí),蛋白降解愈加明顯。由電泳圖譜(圖4)可知,當(dāng)pH 小于5.0時(shí)蛋白回收率逐漸下降可能是由于在較低pH 條件下蛋白分子降解為低分子量的多肽,蛋白溶解性增加,導(dǎo)致沉淀回收的蛋白質(zhì)量減少。

        2.3 pH 值對(duì)褐藻膠絮凝回收蛋白效果的影響

        圖4 不同pH、溫度對(duì)離心上清液中蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜的影響Figure 4 Effect of pH and temperature on SDS-PAGE patterns of protein in supernatant

        圖5 pH 對(duì)褐藻膠絮凝回收漂洗液中蛋白質(zhì)效果的影響Figure 5 Effect of pH on protien recovery from surimi wash water using alginate

        褐藻膠作為絮凝劑已廣泛用于食品加工廢水處理中。由圖5可知,pH 對(duì)褐藻膠絮凝回收蛋白效果影響顯著,且褐藻膠絮凝回收率隨pH 的變化與單獨(dú)調(diào)節(jié)pH 的蛋白回收率變化趨勢一致。隨著pH 的降低褐藻膠絮凝回收率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在pH 5.0時(shí)蛋白回收效果最好,蛋白回收率回收率達(dá)到70.25%。海藻膠絮凝法與調(diào)節(jié)pH 法相比,當(dāng)pH 小于3.5時(shí),海藻膠絮凝法回收蛋白質(zhì)沒有優(yōu)勢;當(dāng)pH 大于3.5時(shí),在相同pH 條件下海藻膠絮凝法的蛋白回收率較單獨(dú)調(diào)節(jié)pH 法顯著提高,在pH 5.0時(shí)褐藻膠絮凝回收率比單獨(dú)調(diào)節(jié)pH 的空白組回收率(47.40%)高出22%。結(jié)果表明,褐藻膠絮凝法結(jié)合調(diào)節(jié)pH 法可顯著提高漂洗廢水中蛋白質(zhì)的回收效果。張宗恩等[10]研究發(fā)現(xiàn),褐藻膠回收魚糜漂洗液中的蛋白質(zhì)在pH 3.78~4.92范圍內(nèi)具有較好的回收效果。

        3 結(jié)論

        (1)鰱魚糜漂洗液中含有大量較低分子量的水溶性蛋白質(zhì)組分,且蛋白質(zhì)主要集中在第1次漂洗液中,生產(chǎn)過程中需重點(diǎn)對(duì)第1次漂洗液中蛋白質(zhì)進(jìn)行回收利用。

        (2)通過調(diào)節(jié)魚糜漂洗液pH 值和控制適當(dāng)?shù)奶幚頊囟瓤捎行Щ厥掌匆褐械牡鞍踪|(zhì)。該方法操作簡單,但單獨(dú)調(diào)節(jié)pH 法的蛋白回收率不是很高,調(diào)節(jié)pH 法結(jié)合褐藻膠絮凝法可顯著提高漂洗液中蛋白質(zhì)的回收效果。

        (3)本試驗(yàn)雖比較了不同方法對(duì)魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)的回收效果,但對(duì)于回收蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)和應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。

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