崔萌萌，馬康，何雅娟，楊蘭

（1.中國計量科學研究院，化學計量與分析科學研究所，北京 100013； 2.北京化工大學化工資源有效利用國家重點實驗室，北京 100029）

藍藻是現(xiàn)存研究發(fā)現(xiàn)的毒性最高、污染范圍最大的淡水藻類之一。水體中的藍藻在非常短的時間內大量生長并聚集就會產(chǎn)生一種異常生態(tài)現(xiàn)象，稱為水華。藻類生長繁殖速度會在水體富營養(yǎng)化的情況下異常加快，水華在這種情況下就會爆發(fā)，這已經(jīng)成為了一個全球性的問題［1］。有關組織通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，亞州地區(qū)和歐洲地區(qū)湖泊富營養(yǎng)化已經(jīng)超過了50%，北美洲和南美洲略微低點，分別是48%和41%，我國則高達67%［2］。近年來，我國幾大淡水湖泊都發(fā)生過藍藻水華大量爆發(fā)的情況。雖然藻類植物釋放到天然水體中的藻毒素含量非常低，但由于藻類水華非常嚴重而且范圍較廣，使水體中的藻毒素的含量呈現(xiàn)上升的趨勢，從而危及人們的飲水安全和健康。藍藻中最典型的毒素就是微囊藻毒素（MC），它是一類肝毒素，它們的結構是由7個氨基酸組成的環(huán)狀多肽［3］，結構通式：環(huán)-（D-丙氨酸-L-X-D-赤-甲基-β-D-異天冬氨酸-L-Z-Adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸），包括3個右旋（D-）氨基酸、兩個可以改變的左旋（L-）氨基酸，其中N-甲基脫氫丙氨酸是一種含有α、β不飽和雙鍵的特殊的氨基酸；Adda結構為3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三基酸-10-苯基-4（E），6（E）-二烯酸。

在MC中表達生理活性的必需基團是Adda結構，由于Adda部分含有共軛雙鍵，MC在某些條件下會轉化為［4（E），6（E）-Adda］MC和［4（Z），6（E）-Adda］MC兩種空間異構體，［4（Z），6（Z）-Adda］MC還未見報道。研究者至今已發(fā)現(xiàn)了80多種MC的同分異構體，其中存在普遍、毒性較強的是MC–LR，MC–RR，MC–YR，（L，R，Y—亮氨酸、精氨酸和酪氨酸）［4–5］，對它們的研究也較多。MC–LF和MC–LW分別含有苯丙氨酸和色氨酸。在MC同分異構體的分子結構中，Adda側鏈是MC中毒性表達的重要基團，失去Adda側鏈后MCs的毒性會降低［6］。MC中常見的具有代表性的異構體分子結構如圖1所示。

對比圖1中MC同分異構體的結構可以看出雖然它們的結構大體相同，但卻存在著明顯的區(qū)別，因而物理性質和化學性質都會存在較大的區(qū)別，分離時難度較大。

MC是具有非常強烈毒性的肝毒素，同樣具有促癌作用，很少的量就會對人和生物體的安全構成威脅。其化學性質非常穩(wěn)定，在強酸、強堿和高溫條件下都不易分解，而且其具有強致毒性，又因其分布較廣，故其危害性不容忽視。醫(yī)學研究顯示，我國江蘇和廣西很多地區(qū)的居民由于長期飲用含微量MC的飲用水而導致肝癌發(fā)病率較高。

人們對MC–LR和總MC限量分別為0.32 μg／L和0.88 μg／L（以成年人為標準）。因為MC–LR在MC中的毒性是最大的，而且促腫瘤作用也非常明顯，其它的藻毒素可能不具有較強的代表性，所以目前人們大多都以MC–LR作為代表用于飲用水中藻毒素含量的限制。世界衛(wèi)生組織認定飲用水中藻毒素的標準限值為1.0 μg／L（以MC–LR為代表），國家環(huán)境保護總局近期頒布的《中華人民共和國國家標準》（GB 3838–2002）中就指出：“居民集中式生活飲用水和地表水源地中MC以MC–LR代表的限值為1.0 μg／L”。

對MC的分離和檢測方法的研究之前已經(jīng)有許多報道。目前普遍采用的方法可以將其歸納為化學分析法、生物法和生物化學法［7］等。

1 化學分析檢測法

化學分析檢測法主要有高效液相色譜（HPLC）、高效液相色譜串聯(lián)質譜（HPLC–MS）、薄層層析色譜（TLC）［8］、氣相色譜［9］串聯(lián)質譜（GC–MS）聯(lián)用、毛細管電泳（CE）［10］等方法。

1.1 高效液相色譜法

在化學檢測方法中目前使用最為普遍是HPLC法［11–12］。目前，WHO、美歐等工業(yè)發(fā)達國家和地區(qū)以及我國權威機構多數(shù)推薦使用HPLC法對MC進行檢測分析。該方法具有重現(xiàn)性好、準確度和靈敏度高的優(yōu)點，且能同時對不同的MC同分異構體進行分析。目前研究報告中有很多關于HPLC檢測MC都集中在對樣品的前處理、色譜分析條件、淋洗劑、洗脫液、SPE柱、濃縮定容過程等的優(yōu)化處理上。

分離MC的固定相有很多種，其中有報道的包括反相C18柱、離子交換柱、酰胺C16柱、內部界面反相柱、XAD–2等大孔吸附樹脂［13］等，研究中大多選用反相C18柱，此種色譜柱的優(yōu)點是其固定相穩(wěn)定、應用廣泛、可在多種溶劑中使用，一般的C18柱pH范圍通常保持在2～8。在檢測MC的實驗中，流動相多采用甲酸或三氟乙酸酸化的水溶液和乙腈或甲醇的梯度洗脫，這可以使大多數(shù)MC分離。Esme［14］等在用HPLC檢測MC時就只采用甲醇作為流動相的有機相，并對MC的一系列異構體進行了分離。房祥軍［15］等在檢測MC時發(fā)現(xiàn)在238 nm下甲醇的本體吸收值高于乙腈。但采用乙腈做流動相時，分離藻毒素柱壓小，基線穩(wěn)定，峰形尖銳，分離效果明顯優(yōu)于甲醇–水流動相。當流動相中加入一定量的三氟乙酸后，峰形較好，分離度提高。而且酸度越低，對色譜柱的保護越有利。通常高效液相色譜儀都連接有不同檢測器，其中使用最多的是紫外（UV）和光電二極管陣列檢測器（DAD）用紫外檢測器進行高效液相色譜分析，能為定量定性提供有效的數(shù)據(jù)，成為鑒定MC的一種可行的方法。Christine等［16］用DAD檢測器對MC進行純度檢測時，證實比用其它檢測器進行檢測得到的結果更精確。由于MC上特殊氨基酸Adda上的烯烴作為主要的發(fā)色團，通常在238 nm處MC有最大吸收的特征光譜，在222 nm處產(chǎn)生最大吸收的色氨酸［17］。閆海等［18］在使用二級管紫外檢測器的液相色譜上進行測定，發(fā)現(xiàn)MC–LR和MC–RR在238 nm波長下吸收峰均最大。

MC在HPLC條件下的檢出限為1 mg／L，而MC在天然水體中含量僅為μg／L水平，故水樣一般都要進行前處理，具體方法是通過富集柱進行濃縮洗脫后用HPLC進行測定。Lee［19］等用高效液相色譜方法檢測水樣中的MC–LR，MC–RR及MC–YR時，發(fā)明了一種可以改變柱效的新方法，在不需要對水樣進行預凈化的情況下，將過濾后的水樣直接在Zorbax CN預置柱進行在線濃縮，濃縮后的被分析物經(jīng)過反相洗脫，在Luna C18柱上分離，這種方法的分析速度、準確度和精密度都非常好，通過將被測毒素的峰面積與標準毒素的峰面積進行比較可對MC定量。

HPLC分析檢測MC的缺點：需要大型貴重儀器，且檢測過程復雜耗時，檢測時需要MC標準物質，目前已發(fā)現(xiàn)的80多種MC同分異構體大多數(shù)缺乏標準物質，MC同系物的定量只能參照MC–LR。由于各實驗室的檢測程序和條件的差異性，可能對MC分析測定對比分析產(chǎn)生一定的影響。

1.2 液相色譜–質譜聯(lián)用技術

高效液相色譜–質譜法簡便、靈敏，廣泛用于監(jiān)測含有MC的環(huán)境樣品。液相色譜–質譜技術具有良好的選擇性，該方法對含有多種藻類毒素的復雜樣品進行分離和鑒定時可以使用。目前只有很少的藻毒素有相應的毒素標準品，但當被測毒素分子量已知時，就可通過準確檢測出檢測物的結構信息對其進行定性分析，對毒素定量分析時可以達到更高的精度和準確度［20］。此法的優(yōu)點是在質譜檢測器上測定分子量和洗脫化合物，其檢測結果具有較好的特異性，不足之處是實驗成本較高。之前在只用光電二極管陣列檢測器（PDA）下不能分辨得到不同多肽類藻毒素的情況下，現(xiàn)在運用質譜檢測器都可以區(qū)分開來，其結果如下：MC–LR，MC–YR，MC–RR的檢測下限分別為37，42，23 ng／L［21］。

虞銳鵬［22］等用水–甲酸–乙腈作為流動相，采用液相色譜–電噴霧質譜（HPLC–MS–ESI）法對水中的MC進行測定，此方法的檢出限達到0.01 μg／L，線性定量范圍為0.02～20.0 μg／L。此種實驗的研究可為水質檢測領域提供快速、靈敏和準確的分析方法。Werawan［23］等利用液相色譜–電噴霧質譜檢測了MC–LR的含量。采用氨水–乙腈溶液在pH 9.7的條件下進行線性洗脫，方法檢出限達到0.1 μg／mL。

張昱等［24］通過固相萃取法對MC進行提取和富集，然后使用HPLC／ESI–MS測定水中的MC–RR，MC–YR和MC–LR，回收率接近90%，線性范圍達到3個數(shù)量級以上（0.5～500 ng／L）。王超［25］等建立了一種液相色譜–二極管陣列檢測器（LC–DAD）／離子阱質譜（ITMS）對水中5種MC的分析方法。水中的MC經(jīng)固相萃取富集和純化，經(jīng)液相色譜分離后，采用DAD和ITMS定性分析和AD定量分析。水中5種MC的檢出限為0.1 μg／L，3個質量濃度加標水平（0.2，0.8，5 μg／L）的平均回收率為（52.2%～115.2%），相對標準偏差為1.2%～10.0%。該方法在進行定性定量分析時可以多種角度同時進行，并可對水中不同的MC進行檢測。超高效液相色譜串聯(lián)質譜（UPLC–MS／MS）技術是近幾年來才發(fā)展起來的，此方法對分析速度的提高有很大的改善。王靜等［26］在檢測水體中MC–LR，MC–RR，MC–LW，MC–LF時，樣品經(jīng)SPE小柱后，UPLC–MS／MS進行檢測，4種MCs的分離與檢測在5 min之內就可完成。Ortelli等［27］運用超高液相色譜–飛行時間質譜（UPLC–Q–TOF）測定了MC的含量，該方法簡便、快速、穩(wěn)定，樣品經(jīng)超聲波提取、過濾后無需任何純化步驟，直接進儀器分析，而且檢測的靈敏度高，水中的MC檢出限為0.1 μg／L，微藻樣品中的MC檢出限達0.1～0.2 μg／g。茅海瓊等［28］發(fā)展了超高效液相色譜–電噴霧串聯(lián)四極桿質譜快速測定水中MC–LR的方法。水樣經(jīng)過前處理后，應用超高效液相色譜–電噴霧串聯(lián)四極桿質譜儀多離子反應監(jiān)測（MRM）對MC–LR進行定量檢測，該方法靈敏度較高，快速簡單易于操作，有利于進行寬濃度范圍準確定量。張明［29］等研究固相萃取–超高效液相色譜–電噴霧串聯(lián)三重四極桿質譜聯(lián)用技術分析水中9種MC的方法。樣品經(jīng)SPE提取和凈化后，以UPLCTMBEH C18色譜柱為分離柱，以0.1%甲酸乙腈溶液作為有機流動相和0.1%甲酸水溶液作為水相進行梯度洗脫，采用正離子模式，多反應監(jiān)測方式進行定性和定量分析。該方法能進行快速分析，檢測范圍更廣，較之前靈敏、準確。運用上述實驗方法分別對杭州市兩處水庫水樣中的MC進行檢測，結果顯示分別有3種和8種MC被檢測出來。

液相色譜質譜聯(lián)用技術較好地解決了單純使用高效液相色譜儀檢測時的部分問題，其缺點是缺少各種MC的標準物質，且實驗成本較高。

1.3 毛細管電泳法

毛細管區(qū)帶電泳、膠束電動毛細管與紫外、熒光、質譜檢測器串接也被用于微囊藻毒素的檢測，該方法具有自動化、檢測樣品量多、用量少等優(yōu)點,且此方法具有柱上富集的功能。同生物法相比，該方法自動化程度更高，且在實驗中不使用放射性物質。但是其靈敏度沒有HPLC高，檢測下限僅為l mg／L［30］。應用激光誘導熒光檢測器可提高檢測靈敏度［31］，但是還需進行進一步的研究和探索。Siren等［32］在對藍藻肝毒素進行分離、純化和鑒別時使用了毛細管電泳和電淋洗質譜技術。首先利用HPLC方法把受試化合物進行預分離，然后在膠束電動色譜（MECC）方法下將這些受試物逐一分離，最后用離線電質譜對分離后的微囊藻毒素進行鑒別和高靈敏度純化驗證實驗，得出MC的檢出限低于1 μg／L。此方法的特點是樣品用量小、分離效率高、分析時間短且柱上富集功能強。但由于重現(xiàn)性差，且缺少MC標準物質，所以目前毛細管電泳法還暫時不能作為水體檢測藻類毒素的常規(guī)手段。

1.4 氣相色譜法

GC–MS聯(lián)用技術主要用于MC總量測定，其檢出限可達到ng／L級。Tsuji［33］等發(fā)明了2-甲基-3-甲氨基-4-氨基鉻酸（MMPB）檢測方法，利用碘酸鈉和高錳酸鉀對提取后樣品進行氧化的原理。MMPB是與MC共同氧化的中間產(chǎn)物，利用GC測定MMPB的含量即可間接獲得MC的總含量，該方法的缺點是只能測MC的總量，無法定量不同的MC異構體。Harada等［34］實現(xiàn)了利用臭氧分解產(chǎn)生MMPB的方法，將存在于甲醇溶液中的藻細胞在–78℃的低溫條件下直接進行臭氧分解，然后用氣相色譜–質譜（GC–MS）進行檢測，30 min內完成整個檢測過程，其檢出限能達到ng／L級。GC–MS的優(yōu)點是能夠靈敏、快速、準確地對痕量MC進行定量，其缺點是儀器設備價格昂貴、不易普及，技術含量高，操作復雜，在缺少標準品的情況下不能對微囊藻毒素進行定性定量，前處理過程也較為復雜，各實驗室的條件和檢測程序千差萬別，對數(shù)據(jù)的分析和判斷都有影響。現(xiàn)階段的研究顯示，在高靈敏度下進行檢測同樣也會對實驗的準確性產(chǎn)生影響，樣品很快會被實驗用品、試劑甚至外界的空氣等污染，而且由于MC本身具有毒性，其氣化進入空氣中也會對人類造成危害。

1.5 薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）是將固定相涂布在平板（玻璃板、鋁箔等）上，點樣后在合適的流動相條件下進行洗脫，平板上不同組分的毒素就會逐漸分離。此方法是利用MC及其衍生物與有色或熒光物質發(fā)生反應的一種檢測技術，目前，它正向聯(lián)用的方向發(fā)展，如薄層色譜–氣相色譜–質譜聯(lián)用（TLC–GC–MS），或薄層色譜–紅外光譜（TLC–IR）等的聯(lián)用。Pelander等［35］使用N，N-二甲基-1，4-苯二胺二氯化物（N，N-DPDD）可以優(yōu)化TLC法檢測MCs，能夠達到WHO規(guī)定的1 μg／L的檢測極限。薄層色譜的優(yōu)點是具有較高的靈敏度及分辨率，可進行快速分離，易于操作，多個樣品的分離可同時進行，樣品預處理簡單。但由于薄層色譜法在檢測水體中藻毒素時無法達到高檢出限、準確定量等實驗的需求，至今未被廣泛應用于實際生活中，只能用于小規(guī)模的實驗室科研工作。

2 生物法

生物法是檢測MC實施最早，最普遍的方法。它通過急性毒素實驗對MC進行定性和半定量檢測。它可快速直觀檢測到新的不同藻毒素，但消耗的毒素量較多，且靈敏度和專一性都不高，不能運用該方法對藻毒素進行準確地定量測定，更不能對不同的同分異構體進行分離和辨認。且當樣品中神經(jīng)毒素和MC同時存在時，肝毒素的毒性就不能顯示。用口腔灌喂法或鼠腹腔注射法是判斷MC的毒性的一種傳統(tǒng)方法。目前，已建立許多種生物系統(tǒng)來監(jiān)測MC，有利用無脊椎動物對毒性評價進行研究，也有利用細菌進行毒性試驗研究［36］。由于MCs能阻礙費舍爾弧菌或明亮發(fā)光桿菌等一些發(fā)光菌發(fā)光，Lawton［37］等利用這一特性檢測了MC–LR和含有5種MCs的藍藻樣品，其LD50的檢測范圍為0.02～0.46 μg／mL。Gehringer等［38］運用植物試驗來檢測水體中的MC，實驗中把家獨行菜作為檢測的物質，將秧苗持續(xù)放置在在1 μg／L MC–LR中2～6 d時，根和葉部都出現(xiàn)了不同的變化。

3 生物化學法

在MC的檢測方法中，生物化學法也是開展比較早的方法。它在檢測MC對人或其它生物的生理活性方面有獨特的優(yōu)勢。生物化學的方法主要分為蛋白磷酸酶抑制檢測法（PPIA）和酶聯(lián)免疫吸附檢測法（ELISA）。

MC對蛋白磷酸酶活性具有專一性抑制的特性，PPIA就是依據(jù)酶活性抑制和MC含量之間的相關關系來測定毒素含量的一種方法［39］。常用的方法包括微量比色法和同位素標記法。該法具有較高的靈敏度，檢測下限可以達到1 ng／mL～1 pg／mL。PPIA方法的缺陷是待測樣品處理需要較高技術，而且常出現(xiàn)MC含量高估計誤差。目前，PPIA常與色譜（如HPLC）結合使用，主要用于水樣和動物組織樣品中痕量MC的檢測。

酶聯(lián)免疫法的原理是用制備的MC單克隆或多克隆抗體，通過免疫顯色反應來測定MC含量。該方法多用于對MC的總量進行測定，最近ELISA方法得到了改進和發(fā)展，現(xiàn)已廣泛用于各種動植物組織細胞樣品、實驗室藍藻培養(yǎng)物和藍藻水華水樣中MC含量的測定。ELISA方法具有高靈敏度，通常能檢測到1 ng／mL，有些能達到1 pg／mL，但由于其較低的選擇性，對MC異構體尚不能進行區(qū)分，只能測定總MC含量。因此，目前ELISA一般在水樣和動物組織樣品中微量MC的檢測及MC快速檢測時使用。

表1中列出了8種常用的MC檢測方法比較結果。

表1 8種常用分析檢測方法比較結果

4 展望

目前，MC檢測技術種類繁多，不同的分析檢測方法利用自身的特點都在追求著多方向的發(fā)展。但是因為各種分析技術及各種條件都存在差異，對MC的測定結果沒有達成統(tǒng)一。現(xiàn)在，許多研究機構致力于對藻毒素的檢測和分離方法的研究，他們提出了各種不同的思路和方法，但均有各自的優(yōu)勢和劣勢。生物法雖然簡單快速，但靈敏度低，沒有特異性；色譜–質譜技術雖然能夠精確定量，但儀器昂貴，技術要求高；生化檢測雖然靈敏度較高，且經(jīng)濟實惠，檢測比較迅速，但目前仍無法解決的是商用試劑盒廣泛供應問題。在定量檢測和分析MC時，高效液相色譜法作為最經(jīng)典可靠的技術，其檢出限可達到ng及以下水平，同時具有選擇性好，結果可靠等優(yōu)點。所以開展有關HPLC檢測MC的方法學研究，用以對各種MC的同分異構體進行分離，盡快研制MC標準物質，從而為進一步發(fā)現(xiàn)并鑒定新毒素，分析其結構特性，為對水質和生物體中MC的研究和控制消除提供更強有力的依據(jù)。

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