丁長春

（文山學院 生物資源開發(fā)研究中心，云南 文山 663000）

鐵皮石斛是名貴中藥材，近年來在全國各地種植規(guī)模日益擴大，云南作為原產(chǎn)地，是最佳種植區(qū)域之一。開展鐵皮石斛人工種植形成了巨大的種苗市場需求，應用組織培養(yǎng)技術專門生產(chǎn)鐵皮石斛種苗的組培工廠如雨后春筍般建立起來，這是目前解決鐵皮石斛種苗缺口的主要途徑，扦插技術乃至共生培養(yǎng)技術僅能夠作為補充方式或潛在的手段。在近年來開展鐵皮石斛種苗工廠化組培快繁生產(chǎn)的過程中，在技術層面遇到了工藝流程建立與優(yōu)化、種源篩選、分化率、污染、玻璃化、畸形苗、移栽成活率等一系列的問題，筆者在努力解決這些問題的過程中積累了一定的經(jīng)驗。作為鐵皮石斛種苗工廠化生產(chǎn)中的關鍵控制點，這些問題的解決是生產(chǎn)質(zhì)優(yōu)價廉的種苗的基礎，是繼續(xù)進行規(guī)模化人工種植的基礎。本文以生產(chǎn)實踐為基礎，對這些問題進行了探討，旨在為正在興起的文山鐵皮石斛組培產(chǎn)業(yè)提供參考。

1 鐵皮石斛種苗工廠化組培快繁中存在的主要問題

1.1 工藝流程的建立與優(yōu)化

完整的鐵皮石斛組培工廠由組培快繁車間、試管苗移栽車間以及大苗培育車間組成。其中組培快繁車間由培養(yǎng)基制備室、清洗室、消毒室、凈化工作室、培養(yǎng)室、溫室等組成，還需要種質(zhì)庫、病毒鑒定室等配套設施。鐵皮石斛種苗組培的工藝流程由技術路線決定，在實際生產(chǎn)中，要在最短時間內(nèi)，用最低的成本生產(chǎn)出最優(yōu)的種苗。首先，與使用莖段、葉片、根等外植體相比較，使用種子作為外植體具有易于獲得、數(shù)量大、無菌系容易建立的優(yōu)點。因此，在繁殖材料的來源問題上，絕大多數(shù)組培工廠都應用蒴果內(nèi)的種子作為外植體，進行組培生產(chǎn)。

在工藝流程優(yōu)化的過程中，成本與品質(zhì)是始終要考慮的核心問題。成本控制方面：在鐵皮石斛組培生產(chǎn)的過程中，人工和電費是主要的流動成本，占直接生產(chǎn)成本的60%以上。完善的技術培訓和科學合理的計件工資制度是降低人工成本的有效途徑，還可以通過合理布局組培工廠的空間，采用流水線設計，減少不必要的人力浪費。吸收其他植物工廠化育苗的成功技術和經(jīng)驗也有助于降低人工成本，比如穴盤育苗技術。在傳統(tǒng)的組培生產(chǎn)過程中，組培苗在1000～3000 lx的人工光照下培養(yǎng)，并使用空調(diào)來控制培養(yǎng)室溫度，使其保持25 ℃的恒溫，雨季還配有除濕機等設備，這是組培室電量消耗大的主要原因，一個年產(chǎn)50萬瓶的組培室為此要支付數(shù)十萬元的電費。實踐證明，將生根苗放入溫室大棚利用自然光進行培養(yǎng)，可以將電的消耗減少60%以上，且苗的生長勢和成活率都得到顯著提高。品質(zhì)提升方面：要建立組培苗質(zhì)量標準，并在入庫環(huán)節(jié)加強監(jiān)督和控制。當然，完整的工藝流程的建立和優(yōu)化還應當包括后面闡述的關于種質(zhì)資源、污染控制、質(zhì)量控制、馴化等問題。

在實際生產(chǎn)中建立的鐵皮石斛種苗工廠化組培技術流程為：建立種質(zhì)庫→種質(zhì)評價與篩選（楓斗型、加工型、鮮食型）→親本選配→人工授粉→種胚培養(yǎng)（室內(nèi)）→原球莖增殖培養(yǎng)（室內(nèi)）→芽體分化培養(yǎng)（室內(nèi)）→壯苗生根培養(yǎng)（室內(nèi)約30 d，室外約90 d）→溫室穴盤移栽→定植（苗床、苗盤、盆栽均可）→采收。

1.2 種質(zhì)庫的建立

鐵皮石斛種質(zhì)資源是對其開展育種工作和其農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成敗的關鍵，應當利用各種可能的途徑收集盡可能多的種質(zhì)資源，建立種質(zhì)庫。在經(jīng)過農(nóng)藝性狀評價和生藥質(zhì)量評價后，再根據(jù)育種目標，選擇最佳親本組合，然后進行種質(zhì)創(chuàng)制。目前，云南省通過鑒定的鐵皮石斛栽培品種極少，還有很多工作需要做。在種質(zhì)收集方面，我們已經(jīng)收集一批多糖含量、化渣性、直立性、萌蘗性、生長速度等方面特異的種質(zhì)，為新種質(zhì)創(chuàng)制奠定了物質(zhì)基礎。

1.3 分化率的控制

在鐵皮石斛種苗組培快繁的過程中，母種質(zhì)量的優(yōu)劣直接決定了產(chǎn)能的大小和生產(chǎn)效率，獲得盡可能多的分化苗是進行生根培養(yǎng)的基礎。因此，在種胚無菌培養(yǎng)體系建立以后，在最短的時間內(nèi)獲得最多的分化苗是生產(chǎn)流程中的關鍵控制點之一。要獲得盡可能多的分化苗，可以選的途徑有加大種胚的培養(yǎng)基數(shù)、分化培養(yǎng)基的優(yōu)化、及時淘汰劣質(zhì)原球莖等。另外，好的雜交組合是確保分化率的物質(zhì)基礎，必須加以重視。

1.4 污染率的控制

污染率的高低直接決定了鐵皮石斛組培苗的生產(chǎn)成本，污染率高的組培工廠（室）在市場競爭中將難以生存。在組培生產(chǎn)實踐中遇到的污染包括細菌污染、真菌污染和螨蟲污染3種情況。細菌污染發(fā)生的原因有母瓶帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、操作人員違規(guī)操作等；真菌污染的原因有環(huán)境衛(wèi)生不潔凈、超凈工作臺性能、培養(yǎng)瓶形式等；螨蟲污染則是由于其體表帶有真菌孢子和細菌，喜歡進入多水的培養(yǎng)瓶內(nèi)所致。從生產(chǎn)過程來看，從培養(yǎng)基配制到無菌接種到培養(yǎng)室環(huán)境各個環(huán)節(jié)都有發(fā)生污染的可能，因此，必須建立科學的無菌意識，并在生產(chǎn)過程中嚴格實施各種防治措施。無菌意識的建立需要進行員工培訓，而無菌意識的維持則需要建立完善的規(guī)章制度。

1.5 玻璃化的控制

植物組織培養(yǎng)過程中，莖、葉呈透明或半透明水浸狀的培養(yǎng)物稱為玻璃化苗。玻璃化大大降低了試管苗有效增殖系數(shù)，嚴重影響了試管苗質(zhì)量，造成人、財、物的極大浪費，必須對其加以控制。在鐵皮石斛組培生產(chǎn)過程中，導致玻璃化的原因主要有高溫、高濕、弱光照、超量使用細胞分裂素等。為降低玻璃化苗出現(xiàn)的幾率，可采取的措施有控制培養(yǎng)室溫度（低于28 ℃）并保持培養(yǎng)室各個高度和角落都均勻、使用帶有透氣孔的培養(yǎng)容器、提高光照強度（不低于1500 lx）、盡量使用自然光、避免使用高濃度的細胞分裂素等。此外，繼代次數(shù)過多，也是導致玻璃化出現(xiàn)的原因之一。

1.6 畸形苗的控制

玻璃化苗是畸形苗的一種，但在鐵皮石斛種胚培養(yǎng)過程中，還會出現(xiàn)玻璃化以外的畸形苗現(xiàn)象，表現(xiàn)特征是生長緩慢、不會長根、莖節(jié)增粗、葉片黃化等。鐵皮石斛組培畸形苗出現(xiàn)的原因不明，可能的原因有使用了影響試管苗生長發(fā)育的化學成分、雜交親本親和性等，有待進一步深入研究。

2 鐵皮石斛組培生根苗的馴化移栽

將組培分化苗植入生根培養(yǎng)基，先在室內(nèi)培養(yǎng)20～30 d，待其新根萌動后即可移入自然光照條件下的大棚或溫室，繼續(xù)培養(yǎng)馴化培養(yǎng)，直至達到出瓶標準（莖高5 cm以上、葉面展開、根長3 cm以上），再進行移栽。移栽前的馴化有利有弊，利在于降低了電能耗、提高試管苗的生長勢和后期移栽成活率，弊則在于由于大棚溫室溫差比較大，環(huán)境潔凈程度有限，可能會增加污染的機會?？傮w而言，利大于弊?？梢酝ㄟ^給大棚溫室增加必要的控溫設施（如水簾、強制通風）、改善地面潔凈度等措施降低污染發(fā)生的機會。

經(jīng)過自然光馴化的種苗即可出瓶移栽。目前，文山地區(qū)乃至云南省普遍采取苗床定植的方式。實際上采用育苗盤或穴盤進行工廠化育苗在蔬菜、花卉等行業(yè)已經(jīng)有許多的成功案例。采用育苗盤或穴盤進行移栽具有集約化程度高、移栽效率高、勞動強度低、種植成本低、便于管理和銷售等多方面的優(yōu)勢。

移栽定植后15 d內(nèi)是管理的關鍵階段，首先，要對種苗和基質(zhì)消毒處理，可以采用廣譜殺菌劑如多菌靈、百菌清等；其次，要注意保濕，可采取增加空氣濕度、葉面噴霧等方式避免種苗脫水；第三，光照強度控制在6000 lx以下，避免強光照導致高溫，使植株水分蒸騰速度加快而脫水。當然，在管理過程中還應注意保持適當通風、及時施肥。在15 d以后，新根萌動，即可進入常規(guī)管理。